RNA病毒严重威胁着人类健康,大部分由病毒引起的传染性疾病的病原体是RNA病毒。小RNA病毒科病毒的基因组复制过程主要由病毒自身携带的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,Rd RP)催化完成。以病毒的基因组为模板,聚合酶以宿主细胞内的NTP作为底物,将单磷酸核苷(NMP)逐个添加到产物链上,最终生成一条与模板互补配对的RNA链。在复制过程中最为核心的NTP添加过程又被称为核苷酸添加循环(nucleotide addition cycle,NAC),该循环由底物结合并诱导活性中心关闭、磷酰基转移反应以及聚合酶向模板下游转位三个主要步骤构成。这些过程的分子机制是聚合酶领域的核心研究内容。脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)Rd RP-RNA-NTP复合物系列晶体结构为我们揭示了RdRP活性中心关闭的模式,同时该研究也提出了Rd RP转位中间体假设。本文采用与PV相同的复合物构建策略,以肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的Rd RP为研究对象,筛选获得了EV71的Rd RP复合物晶体。通过使用不同方式的晶体浸泡策略,在晶体中实现单个和多个核苷酸添加循环,获得了七个分辨率在2.4-2.9埃之间RdRP复合物晶体结构。这些结构展示了EV71聚合酶催化循环中的多个过程,包括NTP结合、聚合酶的活性中心关闭以及磷酰基转移反应。这些结构也验证了Rd RP与其他类型的聚合酶相比,在活性中心关闭和转位这两个关键步骤上具有鲜明的独特性。同时本研究中展示的转位中间体结构显示,复合物中的模板和产物链在转位的初始过程中采取不对称的运动模式,产物链的转位显著领先于模板链,上游碱基对运动幅度大于下游的碱基对。这种不均一的运动模式为剖析转位机制提供了关键信息。该结构中展示的核酸双链不对称运动从未被观测到,甚至从未被考虑到,因此这项研究将有可能具备对核酸聚合酶领域产生高度影响。