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猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, SS2)和猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae, APP)是两种重要的猪传染病的病原,具高发性和高传染性,在世界范围内给养猪业带来巨大的损失。前者还可以引起人患病甚至死亡,具有很重要的公共卫生意义,是一种重要的人兽共患病病原；而后者血清型复杂,国内以1、2、3、7血清型流行为主,防控难度较大。研究表明SS2和APP存在众多的毒力相关因子,而有些毒力因子可以使实验动物对这两种致病菌产生一定的免疫保护作用,因此可作为亚单位疫苗的候选蛋白。以猪链球菌2型HA9801株和猪胸膜肺炎放线杆菌S259株基因组DNA为模板,分别扩增溶菌酶释放蛋白(Muramidase Released Protein, MRP)、猪溶素(Suilysin, SLY)和胸膜肺炎放线杆菌外毒素I蛋白A(actinbacillus pleuropneumoniae toxin IA,ApxIA)抗原性较好的基因片段,再定向克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒mrp-pET28a、sly-pET28a和ApxIA-pET28a,经过酶切和测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出分子量分别为23kDa、26 kDa和40 kDa的融合蛋白。免疫转印结果显示三种融合蛋白都可以很好地被相应的康复血清所识别。用融合蛋白混合ISA-206佐剂制成疫苗免疫小鼠,ELISA测定抗体动态效价显示三种蛋白均能够使小鼠产生很好的特异性抗体(效价最高达1：204800),并且维持高浓度效价(1：12800以上)时间达10周以上。用MRP和SLY蛋白混合起来制成疫苗免疫Balb/C系小鼠、用ApxIA蛋白免疫ICR系小鼠(50μg亚单位/只),经过三免之后,分别用10xLD5o(1.4×108CFU)的SS2 HA9801株和5xLD5o(4×107CFU)的APP1 S259株攻毒。免疫保护试验结果显示：经过MRP和SLY蛋白混合免疫的Balb/C小鼠对SS2的相对保护率为72%；而经过ApxIA蛋白免疫的ICR小鼠对APP的相对保护率为66.7%。在上述研究基础上,设计串联引物,用一段疏水性柔性多肽(GlyGly GlyGlySer)×2碱基序列作连接接头将mrp和ApxIA基因拼接起来,构建ApxIA-linker-mrp串联基因,克隆至pMD18-T Simple载体中,经酶切和测序分析显示插入的片段长度为1521bp,插入的顺序和方向完全正确。再将融合基因定向克隆至pET-28a(+)中,构建重组表达质粒ApxIA-mrp-pET28a,并转化至BL21中诱导表达。得到融合蛋白ApxIA-MRP,免疫转印结果表明其能很好的与两种菌的康复血清反应。用串联的融合蛋白混合ISA-206制成疫苗,三次免疫ICR系小鼠,期间测定抗体动态效价,其血清抗体效价可达1：102400,维持时间长达11周。用该疫苗免疫30日龄的断奶仔猪,共三次免疫,首免lmg/头、二免800μg/头、三免500μg/头；每次免疫结束后1周采集血清测定抗体效价,测定发现抗体效价分别为1：3200、1：51200、1：204800。三免后分别用10倍LD50的APP1S259株及SS2 HA9801株攻击,结果显示对这两种致病菌的保护率分别达80%和100%。证明串联融合蛋白可以对其同源株产生一定的保护率,为SS2和APP的基因工程亚单位串联苗的研制提供了依据。