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前列腺癌是老年男性常见恶性肿瘤,目前已成为第二位危害老年男性健康的恶性肿瘤。由于早期前列腺癌患者一般都无明显临床症状,大部分患者因临床症状就诊时,往往已发生远处骨转移,失去根治性手术时机。大部分前列腺癌患者对初期雄激素剥夺的内分泌治疗效果明显,但随着病情进展,患者仍会不可避免的发展为去势抵抗性前列腺癌阶段,严重影响患者生活质量及生存时间,最终导致死亡。目前对于去势抵抗性前列腺癌,缺乏标准有效的治疗手段,因此迫切需要寻找有效的治疗方法及药物来延缓疾病进展。中国的传统中医药历史悠久,应用广泛,在肿瘤治疗领域也越来越引起大家的重视,具有药效温和、不良反应少、毒副作用低等特点,已成为许多研究者关注的焦点。熊果酸是一种五环三萜烯类化合物,广泛存在于杜鹃花科植物的叶子和果实以及毛地黄科、泡桐和木犀科女贞的叶子中。熊果酸具有广泛的生物学活性,包括抗肿瘤、护肝、抗炎症和抗病毒等。近年来的研究证明,熊果酸对多种恶性肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用,有研究报道,熊果酸对前列腺癌亦有较好的临床治疗效果。本实验通过体外培养前列腺癌DU145细胞,研究和探讨熊果酸对去势抵抗性前列腺癌DU145细胞增殖的影响和促凋亡作用以及相关作用机制。用不同浓度的熊果酸作用于DU145细胞不同时间后,应用CCK-8法、显微镜观察、流式细胞术(FCM)、分光光度法、Western blot等多种方法观察熊果酸对DU145细胞的影响,并探讨相关作用机制,为治疗前列腺癌寻找新的治疗药物提供实验依据。目的通过体外培养去势抵抗性前列腺癌DU145细胞,研究和探讨熊果酸对DU145细胞增殖的影响和促凋亡作用以及相关作用机制。方法体外培养前列腺癌DU145细胞,用不同浓度的熊果酸(10、20、40、80μM)作用于DU145细胞不同时间进行干预,与对照组不加熊果酸相比,CCK-8法检测熊果酸对DU145细胞增殖的抑制率;显微镜下观察DU145细胞形态的改变;流式细胞术(FCM)检测熊果酸对细胞凋亡率和细胞周期的影响;分光光度法检测DU145细胞Caspase-3、Caspase-9活性的变化;Western blot分别检测全细胞内及细胞质和线粒体中细胞色素C、cofilin-1的蛋白表达,细胞质中ROCK、PTEN的蛋白表达。用SPSS 13.0统计软件对所得数据进行统计学分析,计量资料以均数±标准差((?))表示,采用单因素方差分析进行t检验,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1、CCK-8法测定熊果酸对DU145细胞的抑制作用,不同浓度的熊果酸(10、20、40、80μM)作用不同时间(24-72h)后,均能抑制DU145细胞的增殖,随着熊果酸作用浓度的增加和作用时间的延长,其对DU145细胞增殖的抑制作用逐渐增强,其中以80μM熊果酸作用72h后抑制效果最为明显,呈明显的浓度和时间依赖性。2、显微镜下观察,熊果酸组细胞增殖缓慢,随着熊果酸浓度的增加及作用时间的延长,出现体积变小、间隙增大、形态不规则、胞质出现空泡、核仁浓缩、数目减少等细胞凋亡的形态学改变,而对照组细胞贴壁增殖良好,形态无明显变化。3、流式细胞术检测结果显示,不同浓度熊果酸(10、20、40μM)作用DU145细胞48h后,细胞凋亡率分别为8.27±0.72%、12.84±0.75%、21.63±0.97%,呈明显的浓度依赖性增高,与对照组凋亡率6.81±0.61%相比,20、40u M组有显著统计学差异(P<0.01)。细胞周期检测结果显示,累积于G0/G1期的细胞比例增多,而进入S期的细胞比例减少,其中以40u M熊果酸组效果最为明显,有显著统计学差异(P<0.01)。4、分光光度法对Caspase-3、Caspase-9活性检测结果显示,经不同浓度的熊果酸(10、20、40μM)作用DU145细胞48h后,细胞中Caspase-3、Caspase-9活性逐渐增高,呈明显浓度依赖性,有显著统计学差异(P<0.01)。5、Western blot分别检测全细胞内及细胞质和线粒体中细胞色素C、cofilin-1蛋白表达,结果显示,用20μM和40μM熊果酸治疗48h,DU145细胞的细胞质中细胞色素C蛋白表达显著增加、cofilin-1蛋白表达显著降低(P<0.01),而线粒体中细胞色素C蛋白表达显著降低、cofilin-1蛋白表达显著增高(P<0.01);全细胞内细胞色素C、cofilin-1蛋白表达基本不变。检测胞质中ROCK、PTEN蛋白表达,结果显示,UA可浓度依赖性诱导ROCK降解,ROCK蛋白表达梯度性降低,PTEN蛋白表达梯度性增高;对比对照组,20μM和40μM UA组细胞质中ROCK蛋白表达显著降低,PTEN蛋白表达显著增高(P<0.01),具有明显浓度依赖性。结论1、熊果酸对DU145细胞增殖具有抑制作用,呈时间和浓度依赖性。2、熊果酸能浓度依赖性诱导DU145细胞凋亡,并参与细胞周期调控,使细胞阻滞于G0/G1期,S期数量降低。3、熊果酸可通过激活Caspase-9、Caspase-3级联反应的线粒体凋亡途径诱导DU145细胞凋亡,其作用机制之一是UA可通过激活ROCK/PTEN信号通路介导的cofilin-1线粒体转位而使线粒体释放细胞色素C至细胞质中,从而激活Caspase-9、Caspase-3级联反应的线粒体凋亡途径,诱导DU145细胞凋亡。