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新生儿急性肺损伤是新生儿时期常见疾病和主要致死原因之一,国内外研究认为缺氧肺损伤的发病机理主要是:缺氧缺血直接导致肺泡上皮细胞及血管内皮细胞水肿、坏死;氧自由基损伤;细胞因子损伤等。近年来有研究认为肺泡上皮细胞凋亡及相关基因表达异常可能是新生儿肺损伤的重要发病机制之一。HIF-1α是细胞对缺氧适应反应的主要转录因子,它在许多细胞事件中起作用,目前认为HIF-1α在缺氧肺泡上皮细胞凋亡中意义重大。研究缺氧肺损伤AEC凋亡的相关机制及减少其凋亡是防治新生儿肺损伤的一个新策略。
目的:
1.观察缺氧诱导大鼠肺泡上皮细胞株(CCL149,L<,2>型)的凋亡变化,研究凋亡在缺氧肺泡上皮细胞损伤中的作用;
2.初步探讨HIF-1α在缺氧诱导CCL149凋亡中的意义,为进一步研究新生儿缺氧肺损伤的发病机制提供实验基础;
3.应用HIF-1αsiRNA对CCL149进行体外干预并评估干扰效果,为防治新生儿肺损伤提供一个新策略及方向。
方法:
1.以CCL149为研究对象,选择5种不同浓度氯化钴 (Cobalt chloride,CoCl<,2>)作用CCL149,采用MTT法检测各浓度4个时点(4、12、24、48小时)细胞生长抑制率,根据半数抑制浓度(IC<,50>)筛选出COCl<,2>合适剂量建立细胞体外缺氧模型。
2.利用脂质体将构建好的HIF-1αsiRNA转染至CCL149,通过荧光显微镜观察荧光HIF-1α siRNA对缺氧诱导肺泡上皮细胞凋亡影响的实验研究及RT-PCR方法检测其转染效果,检验HIF-1αtsiRNA在CCL149的有效性。
3.实验分为两大组:对照组,包括正常组和单纯缺氧组(分别缺氧4、24、48小时组):HIF-1α siRNA干预组,包括转染后分别缺氧4、24、48小时组。采用Hoechst33342染色荧光显微镜、Annexin V/PI双染流式细胞仪检测各组凋亡变化,采用透射电子显微镜观察缺氧时CCL149凋亡典型形态学变化。
4.采用实时荧光定量PCR、Western Blot检测各组HIF-1α mRNA、蛋白水平变化,结合各组凋亡率,评价HIF-1αsiRNA抑制缺氧诱导CCL149凋亡的效应。
结果:
1.不同浓度COCl<,2>对CCL149的生长抑制率:MTT结果显示,相同作用时间下,随着CoCl<,2>浓度增加,细胞生长抑制率增加;相同作用浓度下,随着CoCl<,2>作用时间增加,细胞生长抑制率增加;通过描绘生长抑制曲线,我们得出作用CCL149 24h半数抑制浓度为467 μmol/L,在后续的研究中选择500 μmol/L浓度COCl<,2>作用细胞建立体外细胞缺氧模型。
2.HIF-1αsiRNA能有效沉默缺氧引起CCL149中HIF-1αmRNA表达:PEGFP-luc转染CCL149 48h后荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染效率50%以上;RT-PCR结果显示:正常组HIF-1αmRNA相对含量为0.906±0.076,缺氧24h组HIF-1αmRNA相对含量为1.576__+0.048,与正常组比较有显著性差异(P<0.01),转染后缺氧24h组HIF-1αmRNA相对含量为0.674±0.035,较缺氧24h组下调57%(P<0.01)。
3.COCl<,2>模拟缺氧可诱导CCL149凋亡:透射电镜检测出CCL149凋亡典型形态学变化,缺氧24h细胞出现体积变小,染色质致密固缩聚集于胞核,核质沿核膜内侧排列等现象;荧光显微镜观察,缺氧4h出现散在凋亡细胞,凋亡细胞核可见浓染致密的颗粒块状荧光,染色不均匀,正常组、单纯缺氧4h、24h、48h组凋亡率(%)分别为:1.50±0.50、5.83±0.76、15.00±3.28、51.50±3.00,随缺氧时间增加CCL149凋亡率增加(P<0.05);流式细胞仪分析显示,正常组、单纯缺氧4h、24h、48h组早期凋亡率(%)分别为:0.379±0.113、4.317±0.055、18.506±2.274、12.768±2.245,单纯缺氧组与正常组比较凋亡率有增加(P<0.01),缺氧48小时细胞出现坏死现象。
4.HIF-1α对缺氧CCL149细胞凋亡的调控:正常组HIF-1α蛋白相对含量为0.21±HIF-1α siRNh对缺氧诱导肺泡上皮细胞凋亡影响的实验研究0.026,单纯缺氧4h、24h、48h组HIF-1α蛋白相对含量分别为0.69±0.035、1.02±0.044、0.71±0.046,较正常组明显增强(P<0.01)。经Pearson相关分析,单纯缺氧组HIF-1α蛋白表达与其凋亡率变化呈正相关(R=0.707,P=0.01)。
5. HIF-1α siRNA对缺氧CCL149细胞凋亡的影响:HIF-1α siRNA干预后缺氧4h、24h、48h组HIF-1α mRNA相对含量分别为:0.32±0.03、0.39±0.23、0.40±0.10,与单纯缺氧各组比较HIF-1α mRNA分别下调72%、70%、67%(P值均<0.01);干预后缺氧4h、24h、48h组HIF-1α蛋白相对含量分别为:0.25±0.046、0.23±0.072、0.28±0.079,与单纯缺氧各组比较HIF-1α蛋白分别下调64%、77%、60%(P值均<0.01)。与此同时,荧光显微镜检测HIF-1α siRNA干预4h、24h、48h组凋亡率(%)分别为2.17±0.76、8.17±0.76、14.33±1.04,与单纯缺氧各组凋亡率比较明显降低(P值均<0.01);流式细胞仪检测HIF-1α siRNA干预4h、24h、48h组早期凋亡率(%)分别为3.559±0.186、1.279±0.489、0.924±0.151,与单纯缺氧各组凋亡率比较明显降低(P值均<0.01)。经Pearson相关分析,HIF-1αmRNA与细胞凋亡率呈正相关(R=0.749,P<0.001)HIF-1α蛋白水平与细胞凋亡率呈正相关(荧光显微镜检测法,R=0.894,P=0.001;流式细胞仪检测法,R=0.781,P=0.013)。
结论:
1.通过在培养液加入COCl<,2>建立了体外AEC缺氧模型,前期实验构建好的HIF-1α siRNA转染至AEC并能够有效的下调其HIF-1αmRNA表达,是沉默AEC中HIF-1α的有效工具。
2.缺氧可以诱导AEC凋亡,随缺氧时间延长,细胞凋亡率增加,提示了AEC凋亡参与了缺氧肺损伤的发病机制。
3.缺氧诱导凋亡时HIF-1α蛋白表达增加,同时HIF-1α siRNA可以通过降低HIF-1αmRNA、蛋白表达而减少缺氧诱导的AEC凋亡,提示HIF-1α参与了缺氧诱导AEC凋亡的发生机制。
4.HIF-1αsiRNA可以减少缺氧诱导的AEC凋亡,为下一步在动物体内研究肺损伤的发病机制奠定实验基础,为防治新生儿肺损伤提供一个新策略及方向。