目的:应激是机体通过神经、内分泌以及其他系统共同参与调节的一种全身非特异适应性反应。适度的应激可以增加机体抵抗外界危险因素的能力,但过度应激也可造成机体的损伤,影响机体正常的心理、生理及代谢功能。精神、心理应激事件在生活中随处可见,在法医学检案中时常遇到被羁押的犯罪嫌疑人或遭受重大生活事件的当事人发生快速意外死亡的案例,经尸表检验无明显损伤,经系统解剖无特异性病理改变,因此死因难以确定。认真分析上述案件的背景不难发现存在一个共同的特点,即均存在明确的心理应激状况。通过系统解剖在排除所有死因的前提下,目前部分学者认为这类死亡为应激性死亡,但尚缺乏足够的科学依据,还有待于进行实验研究给予支持。下丘脑是应激反应的重要调节中枢,因此本研究在成功建立不同时程束缚加冰水游泳应激大鼠模型的基础上,系统观察了下丘脑组织病理学改变、内质网应激信号通路相关蛋白表达变化及糖皮质激素水平变化,旨在探讨应激导致的下丘脑神经细胞损伤是否有内质网应激的参与,为应激状态下死亡机制的研究提供病理形态学依据。方法:1本实验将100只体重为(200±20)g SD雄性大鼠随机分组,分为1天、3天、7天、14天和21天组,每组大鼠10只,并设定相应时间点的各正常对照组10只。采用将大鼠仰卧位固定每日6小时(8:00-14:00)的束缚处理,同时禁食水,束缚结束后进行5分钟冰水游泳。应激各组进行束缚处理时,正常对照组大鼠于饲养笼中,同样禁食水6小时,其余时间各组大鼠自由进食、饮水。各实验组及对应对照组大鼠于实验结束第二天处死,取血留血清做ELISA检测,脑组织经固定、脱水、透明、包埋、连续切片等处理后待做各种染色使用。1)记录大鼠体重变化。2)硫堇特殊染色观察神经细胞尼氏体变化。3)Fluoro-jade B染色观察神经细胞变性坏死情况。4)酶联免疫吸附试验检测血清中糖皮质激素浓度变化。5)he染色观察肾上腺病理学改变。6)免疫组织化学染色观察ers相关蛋白表达变化。2阳性细胞比例及统计学分析:运用全景组织细胞定量分析系统对免疫组化实验中阳性细胞(棕色神经细胞)比例进行统计,目前此软件用于组织细胞计数已在国外得到广泛认可。采用spss21.0统计软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(anova),用最小显著差法(leastsignificantdifference,lsd)作两两比较,以p<0.05为有显著统计学差异。结果:1大鼠体重变化结果随时间的延长,对照组大鼠体重呈上升趋势。与对照组相比,实验1天组大鼠体重略有下降,随后随着实验时间延长,实验组大鼠体重呈上升趋势,但增速相比对照组降低。2硫堇染色结果对照组神经细胞结构清晰,尼氏体均匀分布于胞浆内。束缚加冰水游泳实验1天组和3天组,尼氏体无明显变化;随着应激时间的延长,7天组下丘脑部分神经细胞发生水肿,尼氏体结构不清;14天组部分神经细胞内尼氏体消失,神经细胞固缩浓染,21天组与14天组相比上述病理性改变更为明显。3fjb染色结果对照组和束缚加冰水游泳实验1天组偶见变性坏死阳性细胞,实验3、7天组变性坏死细胞数目增多,实验14、21天组变性坏死细胞数目明显增多。4elisa检测结果与对照组相比,束缚加冰水游泳实验组大鼠血清中糖皮质激素水平从第3天开始显著性增高,7天达到高峰,14天维持在较高水平,但21天时糖皮质激素水平显著性降低,与对照组相比无明显差异。5肾上腺he染色结果与对照组大鼠肾上皮质束状带弥漫大明细胞相比,实验1天组未见明显变化,3天、7天组大暗细胞增多,14和21天组大暗细胞明显增多。6免疫组织化学染色结果6.1grp78免疫组织化学染色结果束缚加冰水游泳实验1、3、7组的大鼠下丘脑grp78神经细胞阳性比例与对照组相比呈明显增高趋势,且在实验3天组到达高峰;实验14天组的神经细胞阳性比例与对照组相比没有明显差别;实验21天组的神经细胞阳性比例与对照组相比降低。6.2atf4免疫组织化学染色结果束缚加冰水游泳实验1、3、7、14、21组的大鼠下丘脑atf4神经细胞阳性比例与对照组相比呈明显增高趋势,且在7天组到达高峰,总体趋势为先增高后略有下降。6.3atf6免疫组织化学染色结果束缚加冰水游泳实验1天组与对照组的大鼠下丘脑atf6神经细胞阳性比例没有显著区别,实验3、7、14天组神经细胞阳性比例呈现明显升高趋势,在14天组到达高峰,21天组回落,且神经细胞阳性比例高于对照组。6.4jnk免疫组织化学染色结果束缚加冰水游泳实验1、3、7、14天组大鼠jnk神经细胞阳性比例明显高于对照组,且呈上升趋势并在14天到达高峰,21天组神经细胞阳性比例略高于7天组。6.5chop免疫组织化学染色结果束缚加冰水游泳实验1天组chop神经细胞阳性比例与对照组相比没有明显差异,3、7、14、21天组神经细胞阳性比例明显高于对照组,且在14天到达高峰。6.6neun免疫组织化学染色结果束缚加冰水游泳实验1、3、7天组和对照组的下丘脑所有细胞中神经细胞所占比例相比没有明显区别,实验14天和21天组神经细胞比例明显降低。结论:本研究成功建立了不同时程束缚加冰水游泳大鼠应激模型,采用酶联免疫吸附试验、硫堇染色、fluoro-jadeb染色、he染色及免疫组织化学染色进行了系列研究。实验结果表明较长时程应激可导致下丘脑神经细胞的损伤。内质网应激PERK-ATF4-CHOP和JNK通路被激活,ATF4、CHOP和JNK呈现出持续性的高表达,提示较长时程的应激导致的下丘脑神经细胞的损伤与内质网应激PERK-ATF4-CHOP通路和JNK通路的激活及高表达有明显相关关系。