主要研究内容和结果如下：　　 第一部分青蒿琥酯抑制角膜血管新生的作用及机制研究　　 1.青蒿琥酯抑制碱烧伤大鼠角膜血管新生的作用　　 构建大鼠碱烧伤角膜新生血管模型，于不同时间点测量各处理组角膜碱烧伤后角膜最长新生血管长度，计算角膜新生血管面积。结果发现，阴性对照组面积为29.30mm2±2.588mm2,0.1％地塞米松阳性对照组面积为8.97mm2±1.576mm2,25μmol/L青蒿琥酯处理组面积为22.02mm2±6.378mm2；青蒿琥酯组和地塞米松组角膜炎症指数明显低于阴性对照组；碱烧伤24小时后对角膜缺损面积测量显示，阴性对照组缺损面积为6.82mm2±1.647mm2,0.1％地塞米松阳性对照组为5.32mm2±1.141mm2,青蒿琥酯组为4.73mm2±0.917mm2。说明青蒿琥酯具有抑制碱烧伤角膜血管新生和角膜炎症反应的作用(P<0.01)，对损伤早期角膜上皮的愈合无影响(P>0.05)。　　 2.青蒿琥酯选择性抑制人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)的增殖　　 (1)青蒿琥酯剂量依赖性抑制HUVECs增殖　　 MTT增殖实验分析青蒿琥酯对HUVECs增殖的作用。结果显示，同对照组相比，青蒿琥酯在6.25μmol/L～100μmol/L的浓度范围内剂量依赖性抑制HUVECs的增殖(P<0.01)。IC50约为25μmol/L。　　 (2)青蒿琥酯对正常人视网膜细胞muller细胞、正常肝细胞株chang liver cell和原代培养的兔角膜上皮细胞(rabbit corneal epithelial cells，RCEpiCs)增殖的作用　　 MTT增殖实验分析青蒿琥酯对muller细胞、正常肝细胞、和RCEpiCs增殖的作用。同对照组相比，25μmol/L青蒿琥酯处理后，正常肝细胞和muller细胞存活率分别为108.11％±5.799％与76.40％±12.214％；50μmol/L青蒿琥酯处理后RCEpiCs细胞存活率为102.78％±1.013％，统计学分析差异没有显著性，说明在低剂量下青蒿琥酯选择性抑制HUVEC增殖。　　 3.青蒿琥酯剂量依赖性诱导HUVECs凋亡　　 Annexin V-PI法标记凋亡细胞，流式细胞仪分析青蒿琥酯对HUVECs的凋亡作用。结果显示，PBS对照组细胞自然凋亡率为5.33％±0.612％，25μmol/L秋水仙素阳性对照组细胞凋亡率为38.98％±1.590％，而12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L青蒿琥酯处理组的凋亡率分别为10.88％±1.036％、21.7％±0.936％、34.48％±1.216％、47.41％±1.180％。说明青蒿琥酯呈剂量依赖性诱导血管内皮细胞凋亡(P<0.01)。　　 4.青蒿琥酯通过线粒体凋亡通路诱导HUVECs凋亡　　 DiOC2(3)荧光染料分析线粒体膜电位。结果显示，与PBS对照组相比，CCCP组细胞平均荧光强度为对照组细胞的43.64％±2.29％，25μmol/L和100μmol/L青蒿琥酯处理24h后，细胞平均荧光强度分别为对照组的63.20％±5.97％和37.07％±4.35％，说明青蒿琥酯呈剂量依赖性导致HUVECs线粒体膜电位降低。Western blotting分析显示，100μmol/L青蒿琥酯处理HUVECs24h后，Bax表达上调，Bcl-2表达下调，Bax/Bcl-2比值升高；青蒿琥酯剂量依赖性促进caspase9和caspase3的切割；100μmol/L青蒿琥酯处理HUVECs16h后细胞浆内细胞色素C水平增多。　　 5.青蒿琥酯通过铁依赖性ROS-p38 MAPK通路诱导HUVECs凋亡　　 (1)青蒿琥酯剂量与时间依赖性特异提高HUVECs中氧自由基(reactiveoxygen species，ROS)水平　　 Carboxy-H2DCFDA和Dihydroethidium(DHE)荧光探针分别检测HUVECs和RCEpiCs中ROS的变化。Carboxy-H2DCFDA检测H2O2为主的自由基，DHE检测O2-为主自由基。HUVECs中H2O2在25μmol/L青蒿琥酯处理后10min开始升高，4h达高峰，随后逐渐回落。Oμmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L青蒿琥酯分别处理HUVECs2h后，细胞内H2O2为主的ROS水平呈剂量依赖性提高(P<0.01)，但相同条件下对O2-为主的ROS水平仅微弱升高，统计学分析差异没有显著性(P>0.05)。说明，在HUVECs中青蒿琥酯产生以H2O2为主的ROS。25μmol/L和100μmol/L青蒿琥酯分别处理RCEpiCs细胞4h，细胞H2O2水平没有变化。说明青蒿琥酯特异地提高HUVECs中ROS水平。　　 (2)青蒿琥酯产生的ROS是铁离子依赖性的　　 第二部分 PEDF抑制视网膜母细胞瘤血管生成和肿瘤生长作用及机制研究　　 1.重组人色素上皮衍生因子(PEDF)的表达纯化　　 将pET30a/PEDF重组质粒转化入BL21(DE3)宿主菌，IPTG25℃低温诱导14h～16h，提取细菌的裂解产物的可溶部分，Ni2+-His Bind Resin亲和柱纯化含有6个His-tag的重组PEDF蛋白，获得高纯度可溶性蛋白。凝胶成像系统对凝胶进行灰度扫描分析显示纯化后重组蛋白纯度可达95％。纯化蛋白用自制兔抗人PEDF抗体进行Western blotting分析鉴定，得到分子量约为50kD的杂交带。　　 2.PEDF抑制视网膜母细胞瘤裸鼠肿瘤生长　　 与PBS对照组相比，PEDF处理组肿瘤生长较慢，在第1次给药后35天处死裸鼠，剥瘤、称重。对照组与PEDF处理组鼠重均在23g～26g，统计学分析无明显差异(P>0.05)；计算和比较各组瘤均重，结果显示：总剂量为12mg/kg的PEDF对BALB/c裸鼠视网膜母细胞瘤(SO-Rb50)生长具有显著的抑制作用(P<0.01)，抑瘤率为68.78％。　　 3.PEDF特异性抑制HUVECs增殖　　 MTT增殖实验分析PEDF对HUVECs和视网膜母细胞瘤细胞株SO-Rb50的增殖作用。结果显示，同对照组相比，PEDF在10nmol/L～320nmol/L的浓度范围内剂量依赖性抑制HUVEC的增殖(P<0.01)。IC50约为80nmol/L。相同剂量PEDF对SO-Rb50细胞没有增殖抑制作用(P>0.05)。　　 4.PEDF特异性诱导HUVECs凋亡　　 Annexin V-PI法标记凋亡细胞，流式细胞仪分析PEDF对HUVECs和SO-Rb50的凋亡作用。结果显示，PBS对照组HUVECs和SO-Rb50凋亡率分别为6.47％±0.48％和3.3％±0.3％，25μmol/L的秋水仙素阳性对照组两种细胞的凋亡率分别为26.05％±2.32％和14.1％±0.4％，200nmol/LPEDF处理组HUVECs和SO-Rb50细胞凋亡率分别为17.18％±2.74％和2.5％±0.04％。说明PEDF仅促进内皮细胞凋亡(P<0.01)，对SO-Rb50细胞没有凋亡诱导作用(P>0.05)。　　 5.PEDF在体内和体外实验中诱导视网膜母细胞瘤向神经元分化　　 从细胞形态以及应用免疫细胞化学方法分析PEDF对SO-Rb50细胞向神经元方向分化的影响。结果显示，药物处理SO-Rb5014天后，1nmol/L的PEDF处理组细胞呈梭形，出现突起；处理17天后组细胞突起明显较前变粗变长；而对照组没有上述变化。免疫细胞化学结果显示，药物处理SO-Rb5017天后，PEDF处理组细胞浆体积明显变大，可见核周、胞浆及突起内神经元标志分子神经元烯醇化酶(neurone specific enolase，NSE)和神经纤维微丝蛋白呈强阳性表达，对照组两种蛋白表达较弱或无表达。说明PEDF能诱导SO-Rb50细胞向神经元分化。　　 7.PEDF下调肿瘤中VEGF表达。　　 第三部分 K5抑制肝癌肿瘤生长作用的研究　　 1.K5特异性抑制人视网膜微血管内皮细胞(human retinal capillaryendothelial cells，HRCECs)的生长。　　 K5剂量依赖性地抑制HRCECs的增殖，IC50为160nmol/L，而对人视网膜周皮细胞(human retinal pericyte cells，HRPCs)的增殖无明显影响。K5处理HRCECs组的细胞凋亡率显著地高于PBS对照组(P<0.01)，表明K5具有诱导内皮细胞凋亡的作用。K5对正常肝细胞(chang liver cell)和肝癌细胞(HepA，Bel-7402)的增殖和凋亡无明显作用，说明K5具有抑制内皮细胞的高度特异性。　　 2.K5抑制肝癌小鼠肿瘤生长的作用。　　 腹腔注射K5总剂量为7.5mg/kg，对昆明小鼠(KM小鼠)肝癌(HepA)实体瘤生长具有显著的抑制作用(P<0.01)，抑瘤率为62％；K5总剂量为12.5 mg/kg时，对BALB/c裸鼠肝癌(Bel-7402)实体瘤生长具有显著的抑制作用(P<0.01)，抑瘤率为68％。