辣椒MYB家族的鉴定及MYB48的克隆与功能分析

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辣椒因其独特的风味和丰富的营养物质深受人们喜爱,辣椒素类物质是辣味形成的决定因素,也是决定辣椒商业价值和保健特性的主要参数之一。但受产地和环境限制,引种、常规杂交育种也很难提高辣椒素含量,相应的品种选育较为薄弱,因此其生物合成路径及调控研究成为基因工程方法提高辣椒素含量的前提和研究热点。筛选分析辣椒全基因组MYB转录因子及其表达模式,有利于揭示其进化机制,为其在辣椒生长发育与辣椒素合成及调控功能的研究提供理论基础。本研究基于Tair、CM334数据库,以拟南芥转录因子为靶序列,利用生物信息学方法筛选鉴定辣椒(Capsicum Annuum)MYB基因家族,并进行理化性质、染色体定位、进化关系、结构域、保守基序、亚细胞定位等分析,以印度鬼椒(Ghost chili)‘黄魔王’为材料,采花后10、20、30、40和50天(d)的果实胎座,通过转录组测序筛选可能与辣味相关的MYBs;重点对转录因子MYB48进行克隆及相关功能验证,并进行生物信息学分析。通过VIGS技术病毒诱导‘黄灯笼’中MYB48基因沉默,建立MYB48表达特性与辣椒素含量变化、辣椒素合成相关结构基因的的动态关系,确定MYB48与辣味关系。主要研究如下:(1)利用生物信息学方法从CM344辣椒全基因组数据库中筛选出172个MYB转录因子,结果表明辣椒MYBs有1R、2R(R2R3)、3R、6R等类型,其中R2R3型居多,结构域分析表明其具有典型的W型R2R3保守基序;获取20个Motif元件并进行位置分析,发现同分支MYB蛋白具有相似的结构特征;进一步与拟南芥聚类得到37个类群,推测具有多种生物学功能。结合转录组测序结果筛选出CA06g03930等12个表达量符合‘黄魔王’辣椒果实胎座组织在不同发育期辣椒素含量变化规律的MYBs,可能与辣味相关,可作为辣味调控的重要的候选基因进一步研究。(2)利用NCBI对CA06g03930进行同源比对并命名为MYB48,从海南‘黄灯笼’辣椒中克隆其序列全长,生物信息学分析表明,其CDS序列全长为717 bp,编码238个氨基酸,为亲水蛋白;蛋白二级结构预测显示其α-螺旋占39.92%,延伸链占7.14%,无规则卷曲占46.64%,β-转角占6.3%,亚细胞定位预测显示其位于细胞核,表明MYB48具有调控功能。与一年生辣椒及番茄MYB48亲缘关系最近,此外与MYB59、MYB108等基因同源性较高,推测MYB48可能涉及苯丙烷类生物代谢合成及花粉生长发育。(3)构建pTRV2-MYB48表达载体,通过VIGS技术在盛花期病毒诱导MYB48基因沉默,通过高效液相色谱法测定辣椒素及二氢辣椒素含量。结果表明花后20天到45天的辣椒素及二氢辣椒素呈上升趋势,并且胎座高于果肉,与前人研究一致。空pTRV2载体侵染的辣椒植株辣椒素及二氢辣椒素含量与未侵染的植株相差不大。感染了pTRV2-MYB48与未处理的辣椒植株相比,花后45天的胎座组织辣椒素和二氢辣椒素的含量分别降低了45.2%和56.7%,果肉组织辣椒素含量降低约44%,表明MYB48具有一定的沉默效果,其缺失能引起辣椒素及二氢辣椒素含量下降。(4)通过Q-PCR测定花后45的辣椒胎座组织中的基因表达,结果显示相较未感染组和感染了空pTRV2的辣椒植株,感染pTRV2-MYB48的辣椒植株MYB48基因的表达显著降低82%,与此同时AT3(82.8%)、Ca4H(81.3%)、4CL(77.5%)、Comt(60.8%)、pAmt(95.6%)、BCAT(91.4%)等基因表达下降,表明这些基因与MYB48表达存在一定的正相关关系。基因Pal(560%)、Kas(159.4%)表达有所增加,与MYB48表达负相关,MYB48可能通过正调控AT3、Ca4H、4CL、Comt、pAmt、BCAT等基因或者通过负调控Pal、Kas影响辣椒素的合成。通过本研究,初步揭示了MYB48基因表达量与辣椒素积累的相关性,与辣椒素相关合成酶结构基因的动态变化关系,为之后通过转录组代谢调控辣椒素生物合成路径提供一定的基础理论。
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