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【研究背景】鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种好发于我国长江以南包括广东、广西、湖南、福建、浙江、香港及东南亚地区的恶性上皮细胞肿瘤。由于其特殊的解剖位置,无论是早期还是局部晚期,放疗是其主要治疗方式。虽然经过规范治疗,使用调强放疗为主,联合诱导、同期、辅助化疗及靶向药物等增敏治疗,临床上仍有大约20%的鼻咽癌患者出现局部复发和远处转移,其主要原因归为放射抗拒。因此,研究鼻咽癌放射抗拒相关基础研究,为鼻咽癌的增敏治疗提供新的依据。自噬作为鼻咽癌放射抗拒的重要原因之一。本课题组前期研究表明:鼻咽癌CNE-2细胞在照射后发生自噬及凋亡,且该自噬在放射致CNE-2细胞凋亡过程中起到促存活功能;放射可以诱导多聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶1(Poly ADP-ribose polymerase 1,PARP-1)激活并且诱导自噬的发生,PARP-1在自噬的上游;在鼻咽癌CNE-2细胞的裸鼠移植瘤中,沉默自噬基因,能增加其放射敏感性。近年来研究表明,LKB1蛋白(liver kinase B1)-单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)(LKB1-AMPK-m TOR)信号通路可能是自噬发生在重要通路,因此,在前期研究基础上,本研究继续探讨放射致鼻咽癌细胞发生自噬过程PARP-1与LKB1-AMPK-m TOR信号通路关系,并深入探讨干扰PARP-1、LKB1-AMPKm TOR信号通路降低自噬活性对鼻咽癌细胞放射抗拒性的影响。研究内容第一部分放射致鼻咽癌细胞发生自噬过程PARP-1与LKB1-AMPK-m TOR信号通路关系的探讨【目的】探明在放射引起鼻咽癌CNE-2细胞自噬过程中,PARP-1是否是LKB1-AMPK-m TOR信号通路的上游信号调控点。(1)证明是PARP-1通过激活LKB1和AMPK,最终激活自噬;(2)确定AMPK的抑制不会影响PARP-1的激活。【方法】1.利用Western blot(Wb)技术检测自噬标志物LC3-Ⅱ,证明鼻咽癌细胞放射后发生自噬。2.利用Wb技术检测放射致CNE-2细胞发生自噬过程中对PARP-1蛋白,LKB1蛋白、AMPK蛋白及m TOR下游P70S6K蛋白磷酸化状态(p-LKB1、pAMPK及p-P70S6K)的影响;利用化学激活剂(5-Aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside,AICAR)激活AMPK,慢病毒介导的PARP-1基因沉默抑制PARP-1和化学抑制剂(Compound C)抑制AMPK后,检测PARP-1、p-LKB1、p-AMPK、p-P70S6K及LC3-Ⅱ的表达变化。【结果】1.鼻咽癌细胞放射后自噬标志物LC3-Ⅱ增加。2.鼻咽癌细胞放射后PARP-1、p-AMPK、LC3-Ⅱ较对照组表达增加,pP70S6K减少。3.AICAR激活AMPK,PARP-1表达不变,p-AMPK增多,p-P70S6K减少,LC3-Ⅱ增多。4.慢病毒介导的PARP-1基因沉默后,PARP-1、p-AMPK表达减少,pP70S6K增多,LC3-Ⅱ减少。5.抑制AMPK,PARP-1表达不变,p-AMPK减少,p-P70S6K增加,LC3-Ⅱ减少,以上各组结果比较均有统计学差异(p<0.05)。6.p-LKB1在各组中的表达量没有明显变化,差异没有统计学意义(p>0.05),而加入AMPK抑制剂Compound C后发现p-LKB1无表达。【结论】鼻咽癌细胞放射后发生自噬,在放射引起CNE-2细胞自噬过程中,PARP-1是AMPK-m TOR信号通路的上游信号调控点。第二部分干扰PARP-1-AMPK-m TOR通路对鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的影响【目的】探讨人为干扰PARP-1-AMPK-m TOR通路下调自噬后鼻咽癌CNE-2细胞的放射线敏感性变化。【方法】1.在不照射线和照射线情况下,分别利用慢病毒介导的PARP-1基因沉默抑制PARP-1、Compound C抑制AMPK后,采用MTT实验检测CNE-2细胞的增殖情况。2.在不照射线和照射线情况下,分别利用慢病毒介导的PARP-1基因沉默抑制PARP-1、Compound C抑制AMPK后,采用克隆形成实验检测CNE-2细胞的增殖情况。【结果】1.MTT结果提示在第1-5天、不照射线情况下,PARP-1基因沉默组增殖与对照组比较无明显差别,差异无统计学意义(p>0.05),Compound C组比对照组增殖减少,差异有统计学意义(p<0.05);照射线情况下,PARP-1基因沉默组、Compound C组比对照组增值减少,差异有统计学意义(p<0.05);照射线下加入Compound C组比不照射线加入Compound C组增殖减少,差异有统计学意义(p<0.05)。2.克隆形成实验结果提示在不照射线情况下,PARP-1基因组沉默组克隆形成数与对照组比较无明显差别(p>0.05),Compound C组与对照组比较克隆数减少,差异有统计学意义(p<0.05);照射线情况下,PARP-1基因沉默组、Compound C组克隆形成数比对照组减少,差异有统计学意义(p<0.05)。照射线下加入Compound C组比不照射线加入Compound C组克隆数减少,差异有统计学意义(p<0.05)。【结论】干扰PARP-1、AMPK后自噬表达降低,能增加鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性。