柑橘是世界第一大水果,2006年,世界柑橘年产量1.1亿吨,面积10730万亩,年贸易额达65亿美元,堪称世界第一大水果。我国是柑橘的重要原产地之一,柑橘资源丰富,优良品种繁多,栽培历史悠久。2006年我国柑橘面积已超过170万公顷,占世界柑橘总面积的23%,居世界第一位,产量近1800万吨,居世界第二位。柑橘已经成为我国南方经济的支柱产业。但是我国柑橘产业虽有一定的基础,但与世界柑橘生产先进国家相比,差距还较大。特别是在品种选育方面还需进一步加强。柑橘是木本植物,存在童期长、珠心胚干扰、高度杂合、遗传背景复杂等缺点,导致常规育种的方法不仅存在很大的盲目性,而且育种效率低。随着生物技术的发展,与传统育种方法相比,利用基因工程培育新品种不受基因型限制,目的基因来源广泛,可以定向地改变目标性状等优点,采用成年态材料作为转化受体,还可以大大缩短育种周期,研究外源基因对植物开花和结果的影响。糖橙由于纯甜似蜜,深受消费者的喜爱。但糖橙种籽较多,目前还没有无核的糖橙品种,同时细菌病害和真菌病害危害较多,增强抗病性也是主要育种目标之一。因此本项研究的目的是建立糖橙的高效再生转化体系和成年态再生转化体系,在此基础上把defH9-iaaM基因,即来自金鱼草的iaaM基因和来自根癌农杆菌的DefH9启动子导入柑橘中,以期望获得具有单性结实能力的新种质。其次,将通过酵母单杂交从番茄中克隆的转录因子TERF1导入糖橙中,期望能够获得对柑橘主要病害如溃疡病、炭疽病有广谱抗性的新种质。通过对转基因的种质进行转基因表达、形态学观测和抗病性等方面的研究,综合评价转基因育种对品种改良方面的作用。本试验获得主要研究结果如下:(1)建立糖橙实生态的再生培养体系。以30d苗龄的糖橙实生态节间茎段不定芽分化率较高,暗培养可以显著的提高不定芽的再生率。筛选出适宜实生态节间茎段再生的不定芽诱导的培养基:MS+5mg/L 6-BA;不定芽增殖培养基:MS+1.0 mg/L 6-BA+NAA 1.0 mg/L;生根培养基:MS+0.5 mg/L NAA。其中采用两步法诱导不定芽再生和生根效果较好。(2)建立了成年态糖橙的不定芽再生体系。用改良的消毒方法G,即采枝梢前一周,每隔一天下午,于温室中将要采取的枝梢用10%的次氯酸钠溶液擦拭一遍,共擦拭4次,且供试植株须隔离放置。再采用70%的酒精处理30s,再用1%的升汞溶液加几滴吐温浸泡24min,无菌水冲洗4次进行消毒。可显著的提高成年态节间茎段的成活率。成年态节间茎段培养基以6-BA 5 mg/L+2,4-D 2 mg/L+IAA 2mg/L培养的效果最好,茎段愈伤诱导率和不定芽诱导率最高可达17.8%和2.87个。对成年态不定芽的嫁接进行了研究,认为经过改良的“⊥”压法成活率较高,可以达到78.94%。(3)建立了将DefH9-iaaM基因和TERF1基因两个外源基因导入到实生态糖橙的转化体系。研究了不同根癌农杆菌对糖橙实生态节间茎段的转化率,结果显示EHA105的转化能力强于LBA4404。浸染时间以15min为宜。针对糖橙实生态节间茎段和成年态节间茎段再生能力的差异性,认为卡那霉素浓度为100mg/L时适合对糖橙实生态节间茎段再生不定芽进行筛选,卡那霉素浓度为30mg/L时适合对柑橘成年态节间茎段再生不定芽进行筛选,通过PCR鉴定,不定芽的转化率高达29.4%。(4)通过PCR鉴定,结果显示以获得了6株转DefH9-iaaM基因植株,通过形态学的研究证实,这6株转基因植株在株高、节间长度、叶面积方面比对照有明显的增长、增宽现象。利用PCR、RT-PCR、Southern杂交技术对转TERF1基因的糖橙进行了分子检测,结果显示,共获得了7株转TERF1基因植株株系。通过对3,7,11号植株的Southern杂交,结果显示TERF1基因已经成功的整合到了糖橙的基因组中,且均为为单拷贝插入。从植株形态特征表现上看,转TERF1基因的植株与未转化植株无显著差异。(5)对转TERF1基因的糖橙进行离体溃疡病和炭疽病的接种试验。通过对病斑大小和数量的分析,结果表明1,3,7,8,11号株系对柑橘溃疡病和炭疽病表现出广谱抗性。接种溃疡病病害时,3号株系对溃疡病的抗病性最强,发病级别为0级。其余转基因植株溃疡病的发病率比对照植株下降了70%左右。进行炭疽病的离体接种7d后发现,转基因植株的叶片基本上都表现出针孔处病斑减小。从照片上可以看到3号和7号转TERF1基因糖橙叶片不仅基本上观察不到炭疽病的典型病斑,而且叶片仍然可以保持翠绿。