背景：胶质瘤是人类神经系统最常见肿瘤,其发病率约为1.34/10万/年,占所有中枢神经系统肿瘤的40%—60%,且以恶性为主,高级别胶质瘤(WHO分级Ⅲ级和Ⅳ级)占75%。尽管以手术为主的综合治疗技术不断改善,但由于胶质瘤本身呈现浸润性生长,加之肿瘤发生原因的多样性及不确定性,治疗后短期胶质瘤复发率仍相当高,胶质瘤总体预后仍很差。综合治疗后胶质母细胞瘤中位复发期为6-12月,间变性星形细胞瘤中位复发期为18-36月。大量临床资料显示治疗后复发胶质瘤生长速度更快,侵袭能力更强,预后更差,总体中位生存期仅为25-35周,其中,复发性胶质母细胞瘤中位生存期为14-50周,复发性间变性星形细胞瘤中位生存期为55-88周。因此,需要进一步深入了解复发性胶质瘤的生物学特性,可以更好地探索新的有效治疗策略和方法。信号传导和转录活化因子3(STAT3, Signal Transducers and Activators of Transcription 3)是细胞信号传导通路JAK2/STAT3途径的关键转录因子,存在于细胞胞浆,参与多种细胞因子、激素和生长因子的信号转导和转录调控,参与细胞的增殖和分化。持续活化的STAT3能够调控许多肿瘤发生的环节,包括细胞周期、凋亡、肿瘤血管形成及肿瘤细胞逃逸免疫系统等。虽然STAT3已被公认为是一种癌基因,但是它本身并不直接引起癌变,而是通过激活其靶基因而诱导某些关键基因产物的表达来影响肿瘤的发生,STAT3的下游靶基因都与细胞增殖、凋亡密切相关,如细胞周期素D1 (Cyclin D1), VEGF, Bcl-2, Survivin等。人脑胶质瘤组织中广泛存在STAT3的过高表达及持续活化,一般认为STAT3在恶性胶质瘤中具有重要意义,但在原发胶质瘤经治疗后的复发过程中,STAT3及其相关下游因子在原发胶质瘤与治疗后复发胶质瘤中的表达变化情况,尚未见报道。进行有关治疗后复发胶质瘤相关因子表达变化的研究,有利于更加深入了解胶质瘤复发机制,探索新的治疗方向,以延缓治疗后胶质瘤的复发和复发后胶质瘤生长速度,从而延长胶质瘤患者生存期,具有实际的临床应用前景。胶质瘤治疗原则是以手术为主,辅以放疗、化疗、基因治疗等多种方法的综合治疗。寻找新的化疗药物一直是胶质瘤治疗研究的热点。含砷化合物作为一种新的抗肿瘤药物从上世纪70年代开始受到人们的重视。三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)是传统中药砒霜的主要成分,作为药物在中国和西方医学的应用历史悠久。上世纪70年代我国学者首次使用As2O3治疗复发性和难治性急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)并取得了显著疗效,这引起了国内外血液肿瘤界的兴趣,并对其治疗作用研究和探讨。目前研究显示,As2O3具有很广的抗肿瘤谱,对血液及其他系统的肿瘤都有一定的作用,2000年9月经FDA特批正式上市,用于治疗APL、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)。自2002年以来,As2O3单独或与其他药物联合治疗多种实体瘤的研究得到广泛开展,对肝癌、胃癌、食管癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌等均取得了一定的治疗效果,其作用机制主要是通过诱导肿瘤细胞分化,同时通过对相关凋亡基因的调控及对一些信号通路的影响,诱导多种实体瘤细胞凋亡。动物实验证实,As2O3能透过血脑屏障,其在脑内的分布浓度较高,可以杀伤肿瘤细胞而对正常胶质细胞无杀伤作用,是一种潜在的抗胶质瘤药物。本实验以人胶质瘤细胞为研究对象,通过对凋亡过程中STAT3因子变化情况的分析,探讨As2O3诱导人胶质瘤细胞凋亡可能的分子机制,为寻找新的有效治疗胶质瘤的药物提供理论依据。第一部分人脑原发和复发胶质瘤细胞中STAT3及相关因子表达变化与胶质瘤预后的相关性研究目的：检测STAT3及其相关因子EGFR、Cyclin D1、HER2、VEGF在人脑原发和复发星形细胞瘤临床标本以研究STAT3异常表达在人脑胶质瘤的复发过程中的意义,分析STAT3表达量的差异与胶质瘤患者无症状生存时间(手术后复发时间)的相关性。方法：1.标本来源：收集山东大学附属省立医院在2003年-2010年间手术切除同一患者原发、复发胶质瘤各24例。手术所取标本部分以石蜡包埋,备用于免疫组化检测,部分即行冻存,备用于组织蛋白提取,用于SDS-PAGE及Western blot检测。按2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准确定病理诊断和分级。2.免疫组化检测人脑原发和复发星形细胞瘤中STAT3及相关因子表达：全部48例标本经甲醛固定和石蜡包埋后,以链菌素亲生物素-过氧化物酶法(SP)法进行免疫组织化学染色,检测STAT3及相关因子的表达。每张切片镜下随机选择5个高倍视野,计数胶质瘤细胞染色的阳性百分率,取均值作为该因子的阳性百分率,行统计学分析。结果1.免疫组化显示共48例标本中均可见STAT3的阳性表达,STAT3在原发组和复发组胶质瘤之间的表达存在明显差异,复发组胶质瘤中STAT3的表达明显增加,且STAT3的高表达与患者的无症状生存期表现明显的负相关性。2.48例标本中均可见EGFR的阳性表达,EGFR在原发组和复发组胶质瘤之间的表达存在明显差异,复发组胶质瘤中EGFR的表达明显降低,且EGFR的高表达与患者的无症状生存期表现明显的相关性,术后放疗有促进胶质瘤患者EGFR高表达的可能。3.共44例标本中可见Cyclin D1的阳性表达,Cyclin D1在原发组和复发组胶质瘤之间的表达存在明显差异,复发组胶质瘤中Cyclin D1的表达明显降低,患者放疗可能与Cyclin D1的表达降低有关。4.共47例标本中均可见HER2的阳性表达,HER2在原发组和复发组胶质瘤之间的表达存在明显差异,复发组胶质瘤中HER2的表达明显增加。5.44例标本中均可见VEGF的阳性表达,VEGF在原发组和复发组胶质瘤之间的表达存在明显差异,复发组胶质瘤中VEGF的表达明显增加,且VEGF的高表达与患者的无症状生存期表现明显的负相关性。结论1.复发胶质瘤患者中STAT3、HER2、VEGF阳性表达明显增加,其中STAT3、VEGF表达量与胶质瘤患者术后无症状生存时间密切相关,STAT3的阳性表达增加在胶质瘤的复发过程中有统计学意义,STAT3可作为判断胶质瘤预后及复发情况的重要指标。2.复发胶质瘤患者中EGFR、Cyclin D1阳性表达明显降低,其中EGFR表达量与胶质瘤患者术后无症状生存时间密切相关,术后放疗有可能促进胶质瘤患者EGFR高表达,同时降低Cyclin D1的表达。3. STAT3可能在胶质瘤的发生、发展和复发过程中发挥着重要的作用,STAT3不仅可作为判断胶质瘤临床预后及复发情况的分子标志,同样可以作为治疗胶质瘤的临床标靶。第二部分As2O3诱导人胶质瘤细胞凋亡对其STAT3表达的影响目的：本实验选取人胶质瘤细胞系U251为研究对象,探讨As203诱导人胶质瘤细胞凋亡的分子机制,通过对凋亡过程中人胶质瘤U251细胞STAT3及下游因子表达情况的测定,研究STAT3信号途径对VEGF、Cyclin D1、p53、survivin表达的影响及关系,分析STAT3在胶质瘤细胞凋亡及血管生成中的作用,旨在探索As2O3诱导人胶质瘤细胞凋亡可能的分子机制。方法：1.体外培养人胶质瘤U251细胞,细胞常规培养于含10%新生小牛血清、含青链霉素100单位/m L的高糖DMEM培养基中,置于饱和湿度、37℃、5%CO2的培养箱中。2.MTT法测定As2O3作用后U251细胞的存活率,取对数生长期的细胞,实验组加入2、4、8μmol/L,以PBS为阴性对照组,分别作用24、48、72小时,然后上酶标仪,以空白对照孔调零,检测490nm处的吸光度,以PBS阴性对照组A值为对照,计算细胞存活率及抑制率。3.As2O3作用后胶质瘤U251细胞超微结构变化的观察,取对数生长期细胞,加入As2O3溶液,浓度为4μmol/L,作用24小时后,经戊二醛固定后制作透射电镜切片,在电镜下观察As2O3引起的细胞超微结构变化。4.Western Blot检测As2O3作用后胶质瘤U251细胞中STAT3、P-STAT3的表达变化。5.流式细胞术测定As2O3作用后人胶质瘤U251细胞的DNA细胞周期,取加入As2O3溶液作用24、48小时的胶质瘤细胞,用低渗缓冲液进行PI染色后,应用流式细胞仪检测胶质瘤细胞的DNA细胞周期。6. AnnexinⅤ-FITC-PI双染法观察As2O3作用后人胶质瘤U251细胞的早期凋亡,取生长旺盛的细胞传代培养24h,以4μmol/L的As2O3溶液分别作用于胶质瘤细胞24h、48h、72h,以AnnexinⅤ-FITC—PI双染法标记U251细胞,用流式细胞仪观察其早期凋亡。7.TUNEL法观察As2O3作用后人胶质瘤U251细胞的中晚期凋亡：制备细胞爬片,4μmol/LAS2O3溶液分别作用于胶质瘤细胞24h和48h,以TUNEL法观察As2O3溶液引起的中晚期凋亡；光镜下计数阳性细胞计算凋亡指数。8. RT-PCR检测VEGF、Cyclin D1、p53、Survivin mRNA的表达：以4μmol/L的As2O3分别作用于胶质瘤细胞24h和48h,应用RT-PCR检测As2O3作用于胶质瘤细胞后VEGF、Cyclin D1、p53、Survivin mRNA的表达变化。结果：1.MTT结果显示,As2O3作用下实验组U251细胞存活率明显低于对照组细胞,As2O3对U251细胞的抑制作用具有时间和浓度依赖性,细胞存活率随药物浓度增加而变小。2.As2O3作用U251细胞24h后,可在细胞内观察到已呈早期凋亡的形态变化：细胞体积变小,细胞表面微绒毛减少,核内染色质趋边凝聚明显,即染色质边缘化。3.U251细胞中存在STAT3的高表达和P-STAT3的表达,经As2O3作后,STAT3和P-STAT3蛋白的表达明显降低。4.FCM检测可见,随As2O3作用时间延长,细胞周期中G1期细胞增多,G2、S期细胞减少,提示细胞周期明显阻滞于G1期。5. AnnexinⅤ-FITC-PI双染法检测结果表明,As2O3作用于U251细胞可出现明显的凋亡特征。6. TUNEL结果显示,As2O3作用24、48h时计数U251细胞阳性率分别为7.7±1.73和12.2±5.25。7. RT-PCR结果表明,经As2O3作用后,人胶质瘤U251细胞p53mRNA表达升高,VEGF、Survivin、Cyclin D1 mRNA表达下降,存在时间依赖性。结论1.As2O3对人胶质瘤细胞系U251具有抑制作用,可诱导其凋亡并阻滞其细胞周期进程,细胞凋亡的程度存在浓度及时间依赖性。2.凋亡发生的可能机制与As2O3作用后凋亡相关基因p53表达增高和凋亡抑制基因Survivin的表达下调有关,而Cyclin D1的表达下调可能是其阻滞细胞周期进程的机制。3.人胶质瘤细胞系U251中存在STAT3蛋白的过度表达和磷酸化激活,As2O3作用后,STAT3及其激活产物P-STAT3的表达下降,可能作为U251细胞凋亡相关基因和细胞周期调控基因的上游基因,参与了诱导U251细胞的凋亡及细胞周期阻滞进程。STAT3的过度表达和磷酸化激活与As2O3诱导U251细胞凋亡的作用密切相关4.As2O3抑制细胞增殖,诱导其凋亡,阻止血管生成可能是其抗肿瘤作用的重要机制。