【摘 要】
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为了研创B7-PE40KDEL新型重组外毒素整合蛋白,同时也为今后更深入地探讨B7-2和B7-1分子在调控T细胞增殖、分化及相关信号传导过程中的作用,该研究首先通过PCR克隆获得了含编
【出 处】
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中国人民解放军军事医学科学院 解放军军事医学科学院
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为了研创B7-PE40KDEL新型重组外毒素整合蛋白,同时也为今后更深入地探讨B7-2和B7-1分子在调控T细胞增殖、分化及相关信号传导过程中的作用,该研究首先通过PCR克隆获得了含编码人B7-2和B7-1分子胞外区的cDNA.我们采用重叠延伸PCR（SOE-PCR）基因融合技术,通过引物设计并将内质网蛋白滞留序列KDEL引入PE40的C-末端,由此构建成功了含编码B7-1-PE40KDEL和B7-2-PE40KDEL的全新型融合蛋白基因,长度分别为179bp和1842bp,它们各自包括了B7-1和B7-2的胞外区以及PE40的跨膜和细胞毒功能区.为获得全新型B7-2-PE40KDEL融合蛋白的高效表达载体,该研究参考外源基因高效表达的数学模型,采用了高通量筛选策略,将所设计构建的并经优化密码子和二级结构的B7-2-PE40KDEL融合毒素基因分别定向插入到pBV220、pTYB4、pGEX-4T-2和pRSETA等二十余种表达载体中,筛选鉴定正确的重组表达质粒后并转化相匹配的最佳菌株如BL21（DE3）、BL21（DE3）-CodonPlus-RIL中,根据载体不同类型分别进行温控或化学等诱导表达.由于该研究构建的pRSETA-B7-2-PE40KDEL表达载体所建达的目的蛋白N端融合有6个组氨酸残基标记,这十分利于通过Ni-NTA金属鏊和层析来进行表达产物纯化.因此对所表达目的蛋白的可溶性组分建立了金属螯合层析柱-Q阴离子交换层柱-SephadexG-75凝胶过滤层析三步纯化法,可获得电泳纯的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白.上述结果表明,我们所提出的分子设计并研创新一代全新型免疫抑制重组B7-2-PE40KDEL外毒素整合蛋白的策略是科学的、创新的和可行的,有望在今后特异性防治GVHD和HVG的研究与应用中发挥重要作用.
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