论文部分内容阅读
目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种老年人常见的神经系统退行性疾病,是痴呆最常见的病因。目前AD的病因学和发病机制尚不清楚,也没有特异的早期诊断AD的生物学标志及有效的治疗措施,因此,AD的防治仍为世界性的医学难题。大量研究证实Aβ纤维在大脑皮质的堆积形成老年斑是AD病理发生早期的关键性事件。此外,临床病理研究发现AD患者的痴呆症状严重程度与脑组织中神经原纤维缠结(NFTs)的数量呈正相关,NTFs的主要成分为过度磷酸化的tau蛋白,提示tau蛋白异常过度磷酸化与AD的发病机制直接相关。Tau蛋白是神经细胞主要的微管相关蛋白,对促进微管形成、稳定微管系统起着重要作用。在AD患者脑中,聚集成PHF的过度磷酸化的tau蛋白(PHF-tau)明显增加。冈田酸(okdaic acid, OA)是蛋白磷酸酯酶PP-2A与PP-1的抑制剂,在离体培养的海马神经元中能够诱导tau蛋白过度磷酸化;同时,OA在体内能促进Aβ沉积,造成神经元退化,突触缺失及记忆障碍,产生类AD样病理特征。绿茶多酚(green tea polyphenols, GTPs)是从绿茶中提取出来的一种多酚类化合物,研究表明GTPs对癌症、心血管疾病、炎性疾病及神经变性疾病等均具有防治作用。但GTPs对AD中的tau蛋白的过度磷酸化是否具有抑制作用尚未有文献报道。本实验室前期研究证实GTPs能够减轻OA诱导的大鼠海马神经元tau蛋白的过度磷酸化,改善大鼠记忆损伤状况。因此,我们在前期实验的基础上,通过OA损伤大鼠原代海马神经元,在离体细胞水平上进一步观察并探讨GTPs的神经保护作用。方法:选用出生24小时内的SD大鼠,无菌分离并培养海马神经元,倒置显微镜进行形态学观察,培养至第7天,经冷丙酮固定后,尼氏染色鉴定神经元。将实验组分为6组,分别为正常对照组(normal),DMSO对照组(vehicle-control),OA损伤组(OA model)和GTPs保护组(OA+GTPs,GTPs浓度分别为5μg/ml,15μg/ml,25μg/ml)。将海马神经元培养7天后,分别将等体积的培养液、含DMSO(终浓度<0.01%)的培养液,终浓度为10 nmol/L的OA以及OA (10 nmol/L)和终浓度分别为5μg/ml,15μg/ml,25μg/ml的绿茶多酚加入培养海马神经元中,37℃、5% CO2孵育12小时。倒置显微镜下观察OA及OA+GTPs作用于海马神经元后细胞的形态学变化;MTT微量比色法检测OA及OA+GTPs对海马神经元的存活率影响;分光光度法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量的变化。免疫细胞化学法观察Ser396位点的磷酸化tau蛋白的定位与表达分布情况,Western blot方法检测海马神经元内磷酸化的tau蛋白的表达并进行定量分析。结果:1.海马神经元鉴定:原代培养大鼠海马神经元,倒置显微镜进行形态学观察,尼氏染色鉴定神经元,细胞胞浆内蓝紫色颗粒及明显的空泡状核,为神经元所特有,占细胞总数90%以上。细胞的数量与状态可用于本研究。2.细胞形态学变化:正常海马神经元胞体呈椭圆,轮廓清晰,轴突交错成网,而OA模型组(10 nmol/L)的海马神经元明显减少,胞体呈不规则圆形,轴突明显退化、缩短、断裂;GTPs处理组中,低剂量保护组(OA 10 nmol/L+GTPs 5μg/ml)与OA没有明显差别,中、高剂量保护组(OA 10 nmol/L+GTPs 15μg/ml、OA 10 nmol/L+GTPs 25μg/ml)较OA组细胞数增多,可见轴突缩短、断裂现象明显减少,神经元胞体之间的轴突仍可见连接成网状结构。3.细胞存活率及LDH:OA 10nmol/L损伤及不同浓度GTPs与OA共同孵育作用于海马神经元后,MTT检测细胞存活率,上清检测LDH含量,可见OA模型组比正常对照组及DMSO组细胞存活率明显降低(P<0.05 ),LDH含量明显增多(P<0.01);GTPs保护组较OA模型组存活率明显提高(P<0.05 ),LDH漏出明显减少(P<0.01),以GTPs 15μg/ml及25μg/ml剂量组明显。4.海马神经元过度磷酸化tau蛋白的表达:免疫细胞化学结果显示,OA模型组海马神经元胞体和突起的pTau-Ser396表达较正常对照组和DMSO对照组显著增多,呈棕黄色染色,GTPs保护组的pTau-Ser396阳性表达较OA模型组明显减少。Western blot实验进一步证实免疫细胞化学的结果,定量分析表明,OA模型组pTau-Ser396的表达量比正常组和DMSO对照组增加,而GTPs保护组表达量则比OA模型组降低,尤其以GTPs 15μg/ml及25μg/ml剂量组明显,具有统计学意义(p<0.01)。结论:冈田酸能够诱导大鼠原代海马神经元tau蛋白过度磷酸化并引起神经元死亡,轴突断裂、损伤,降低细胞存活率,绿茶多酚能够减轻冈田酸的毒性损伤,提高细胞存活率,降低tau蛋白过度磷酸化程度。