目的意义:脊髓损伤是临床上非常严重的损伤,给很多患者带来沉重的负担。虽然目前很多学者们致力于从病理结构和分子层面上去研究脊髓损伤的机制和寻找治疗的办法,仍差强人意。脊髓的原发性损伤和复杂的继发性损伤会导致上下行神经轴突的损伤,进而导致行为学功能的丧失。不管是人类还是动物,脊髓损伤都会不可避免的出现损伤病灶或者坏死空洞,从解剖的角度上来说这也是导致轴突再生失败的主要原因。通过在损伤区域移植细胞来代替受损或凋亡的细胞为治疗脊髓损伤提供了可能,因为轴突可能通过细胞而长入损伤区域,为轴突再生创造了条件。另一方面,活性的胶质细胞以及细胞外基质形成的胶质瘢痕也是限制轴突再生的关键因素,移植细胞能和宿主机体互相融合生长也为轴突的再生提供可能。此外,轴突通过作用于新的受体以及形成新的突触才能促进功能的恢复。所以通过细胞移植治疗脊髓损伤是非常有必要的。雪旺细胞(SCs)移植被认为是脊髓损伤后最有希望的选择,它能够分泌多种神经因子,细胞外基质以及粘附分子,这些都能促进轴突的生长。目前来说SCs移植的最大障碍就是其在宿主体内的迁移受限。移植的SCs后与宿主的星形胶质细胞很难互相融合生长,SCs被星形胶质细胞限制在损伤区域内很难迁移。研究显示迁移受限与损伤后硫酸软骨多糖蛋白(CSPGs)的生成有很大关联,其在移植的SCs和星形胶质之间形成限制轴突生长的障碍。已经有体内实验证实通过应用硫酸软骨素酶(Ch ABC)可以特异性消化CSPGs,进而促进SCs细胞和星形胶质细胞融合生长。本研究通过应用慢病毒介导的硫酸软骨素酶(lentiCh ABC)转染宿主体内,使其能够在瘢痕区域消化CSPGs,从而促进SCs的迁移,并进一步观察轴突再生以及行为学功能的恢复。材料与方法:1.分离成年GFP大鼠双侧坐骨神经后,在显微镜下剥离系膜和外膜组织,在体外利用植块法培养6w,然后用酶消化,进行原代培养、传代、扩增和纯化,并进行细胞计数、免疫组化法纯度测定。2.通过lenti-Ch ABC转染T293细胞,转染7天(d)后取上清液,通过DMB assay检测酶活性,将10μl细胞的上清液和10μl chondroitin sulfate(0.25mg/ml)在37℃下共培养。将180μl的DMB solution(将16 mg DMB,2.37 g Na Cl,3.04 g glycine,75 ml 0.1 M HCl溶解在1L dd H2O中)添加到已经反应的混悬液中,同时加入空白对照组和商品Ch ABC组,然后测660nm波长处吸光度OD值。体外实验中将lenti-GFP用微量注射器注射到大鼠脊髓中去,2w后灌注取材,在显微镜下观察其在体内转染表达情况。3.将健康成年SD大鼠随机分成五组,分别为正常组(n=10),对照组(control组,n=12),SCs细胞移植组(GFP-SCs,n=12),lenti-Ch ABC组(n=12)和联合治疗组(lenti-Ch ABC+GFP-SCs组,n=12)。四组动物分别利用NYU仪器建立T10脊髓挫伤动物模型,手术后在损伤区域中心点处用8-0无损伤线缝合予以标记,术后7-10d,按照原手术入路显露脊髓损伤处硬脊膜,SCs组通过微量注射器在损伤中心部位注入SCs悬液5μl(1×106细胞);LentiCh ABC组通过微量注射器在损伤两端部位各注入2μl lenti-Ch ABC(3.0×105TU/μl);Lenti-Ch ABC+GFP-SCs组同时注射SCs和lenti-Ch ABC;Control组注射等量DMEM。4.BBB评分,将大鼠置于直径为1m的平台上,保持室内安静的情况下测试,术前2w使大鼠熟悉环境并测试baseline、术后3d、以及术后每周对动物行BBB评分,评分前给大鼠排尿,以减少排尿反应时的干扰。5.Grid walk:于第4、8w时检测Grid Walk,将大鼠置于两端架起的网格80cm×80cm区域上,网格大小为2cm×2cm。把大鼠放置在网格上,观察其在网格上自由行动时后肢掉下来的次数。一般计算方法为双侧后肢掉下来的次数总和与所走的步数总和之间的比例。在损伤后第4及8w各测试一次。6.Hargreaves:使用热痛测试法(thermal paw withdrawal latency,TPWL)进行热痛测试。将大鼠置于有盖的有机玻璃箱内(20cm×25cm×15cm),底部为厚玻璃板,适应30分钟(min)后使用热辐射刺激仪(SERIES 8 Model 390G IITC Life Science,美国)检测大鼠足底中心处对热痛的反应,记录从开始照射到反射性抬脚的时间。时间上限设为20s,如果20s后仍没有反应,应放弃,5min后重复检测。总共重复测量6次,每次间隔5 min,去掉最低值和最高值后取4次的平均值,作为该实验点的热痛阈值。在损伤后第4和8w检测。7.尿功能检测:采用Metabolic Cage收集大鼠尿液,Metabolic Cage表面涂有特殊的材料和陡峭的倾斜面的漏斗以保证尿液的收集。采用特殊的喂食器,防止食物的散落,并可保证长时间的测试收集,所有通过电脑进行分析。可检测的数据有恒定时间内排尿的频率,总尿量以及每次排尿的尿量。本研究测试当日晚8点至第二日早8点连续12小时的尿量。8.免疫组织化学染色:8w后处死动物,取损伤段脊髓作25μm纵向快速冰冻切片后,进行P0、ED-1、Reca-1、Tunel观察SCs的存活及在宿主体内的功能性作用;CS56、GFAP、2B6、观察损伤后局部CSPGs的变化;通过观察GFP-SCs检测细胞迁移的距离;TH和5-HT标记神经轴突再生。免疫组化切片染色用图像分析软件Image J分析处理。各种统计学处理采用统计软件Graphpad 6.0进行分析。研究结果:1.SCs培养细胞生长状态好,扩增速度快,培养10d后可获得大量细胞,能够在体外稳定传代,可扩增至第4代。经纯度检测显示纯度约为98%。2.T293转染lenti-Ch ABC 1w后能持续分泌有效的Chondroitinase,可消化降解chondroitin sulfate,通过与阳性对照组对比证实lenit-Ch ABC可在体外实验中成功转染。Lenti-GFP在体内注射2w后观察其能在脊髓体内转染并表达,在注射区域可大量GFP转染区域,在较远区域仍可见其表达。3.脊髓损伤后BBB几乎为0,术后1-2w上升明显,4w以后BBB评分各组之间有差异,显示实验组较对照组分值高,各组之间差异有统计学意义检验(p<0.05),其中联合治疗组行为学功能恢复最好。进一步分析8w各组之间体重无差异,在第8w各组之间的分值比例差值比较大,BBB比较有差异。Grid walk实验显示损伤后失误率较高,接近80%,治疗组在第4、8w恢复最好,其中联合治疗组失误率最低,有显著性差异(p<0.05)。Hargreaves检测发现损伤4w后各组出现热痛觉敏感的情况,但8w后大致恢复到正常水平,各组之间无显著性差异,未出现疼痛异常的情况。4.Metabolic cage显示排尿次数明显降低,但实验组恢复明显,联合治疗组功能恢复最好(p<0.05)。每次排尿量容积在对照组比空白组明显增加,实验组有好转,联合治疗组显著恢复(p<0.05)。5.通过P0检测SCs有良好的髓鞘化性能。ED-1显示SCs能够存活于宿主体内,可见少量巨噬细胞吞噬SCs。Tunnel阳性率低提示SCs生长状态良好。Reca-1提示SCs能够促进血管生长。6.CS56和2B6显示损伤组CSPGs表达增多,而联合治疗组CS56表达显著性减少,2B6显著性增多。且GFAP在联合治疗组中表达明显降低。7.通过在显微镜下检测GFP-SCs在脊髓体内的迁移,证实经lenti-Ch ABC治疗能明显促进SCs的迁移。8.通过TH和5-HT标记轴突纤维,损伤组可见损伤区域巨大空洞形成,仅有少量轴突生长,治疗组能明显减少空洞面积并促进部分轴突再生,而联合治疗组在Graft、Host以及Total处轴突再生明显(p<0.01),较其他组有较多的轴突穿过缺损部位。并与行为学功能的恢复具有相关性。进一步统计发现TH和5-HT标记在损伤尾侧(0.5mm)部位的轴突联合治疗组显著性高于其他组(p<0.05)。研究结论:1.通过使用组织块法体外培养SCs细胞,SCs具有较高的生长活性,纯度高,稳定性好,为细胞移植提供足够来源。2.Lenti-Ch ABC能够成功转染T293细胞并持续分泌Ch ABC,并且在宿主体内中也能稳定表达。3.SCs能分泌多种神经营养因子和细胞外基质,有利于轴突生长。SCs具有细胞桥接和空洞充填等作用。移植的SCs能够包绕轴突形成髓鞘。移植的SCs在宿主体内存活良好,凋亡率低,并能促进损伤区域的血管再生。移植的SCs较少被巨噬细胞吞噬。4.Lenti-Ch ABC和SCs均能够促进BBB行为学恢复,在4w之后较明显,联合治疗组显著恢复,在8w之后BBB分值最高;治疗组能够降低Grid walk失误率,联合治疗组在第4、8w均能显著降低Grid walk失误率。Hargreaves检测显示损伤后4w出现热痛觉敏感的情况,但没有显著性差异,8w后各组趋向正常。5.联合lenti-Ch ABC和SCs能够改善膀胱尿道功能,使得排尿频率增加,每次排尿量容积减少,接近正常组。6.联合lenti-Ch ABC和SCs能够持续有效分泌Ch ABC,通过消化CSPGs,减少CS56的表达,增加消化CSPGs产物2B6的表达,并且能够降低星形胶质的活性。7.联合lenti-Ch ABC和SCs能够消化CSPG,消除影响SCs迁移的屏障。促进SCs迁移,而SCs治疗组未见明显迁移。8.联合lenti-Ch ABC和SCs能够促进损伤区域TH和5-HT轴突的再生,联合治疗组可见大量轴突再生穿过损伤区域,并且能够保护损伤区域尾侧的轴突。