论文部分内容阅读
本文通过对小金海棠转录因子MxMYB176在干旱胁迫下的功能研究以及该基因上游启动子的结构和功能分析,以探究转录因子MxMYB176响应干旱胁迫的分子机理,取得如下的研究结果:提取小金海棠根系总RNA,进行半定量PCR,发现干旱胁迫下MxMYB176转录因子的表达量显著增强。与野生型拟南芥相比,转MxMYB176基因的拟南芥在含有300 mmol/L甘露醇的培养基中的长势较好,转基因株系的主根长是WT的1.84倍。在干旱胁迫下转1300-MYB176拟南芥体内的丙二醛（Malonic Dialdehyde,MDA）含量明显低于转空载（1300）和野生型（WT）拟南芥;脯氨酸大量积累;H2O2的含量明显低于转空载（1300）和野生型（WT）拟南芥;超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）酶活性显著高于转空载（1300）和野生型（WT）拟南芥;花青素和类胡萝素含量也显著高于转空载（1300）和野生型（WT）拟南芥;叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素均显著增加,但叶绿素a/叶绿素b没有明显变化。结果表明,转入小金海棠MxMYB176基因能明显提高拟南芥的抗旱性。利用PCR扩增克隆得到长为1275 bp小金海棠MxMYB176转录因子上游启动子pF,应用在线软件进行生物信息学分析;结果表明,MxMYB176基因启动子上包含有光敏元件、响应脱落酸诱导、受茉莉酸诱导、受低温诱导、受赤霉素诱导、GBF3转录因子绑定位点等多种顺式作用元件。成功构建p9::GUS（950bp）、p6::GUS（653bp）、p3::GUS（313bp）三个5′端不同片段缺失的植物表达载体,通过转化农杆菌,注射烟草进行瞬时表达分析发现,融合不同片段大小启动子驱动的GUS基因的表达强弱依次为pF>p9>p6>p3,其中p3片段中GUS基因几乎不表达。将不同片段启动子转化拟南芥分析其稳定表达,发现随着删切片段的增加MxMYB176启动子活性减弱,全长启动子pF的GUS蛋白酶的活性为0.0303 nM·Min-1·μg-1分别是p9、p6、p3的1.8、5.3、24.1倍,在植株中的稳定表达呈现出与瞬时表达一致的趋势,且在转p6片段启动子的植物中MxMYB176启动子在绿色组织中的活性明显减弱,在转p3片段的启动子植株中只在拟南芥根系有微弱的GUS基因表达而在的叶片上未观察到有GUS基因的表达。由此推断MxMYB176启动子响应胁迫应答的核心区域在-950 bp--653 bp之间。通过对不同甘露醇浓度梯度处理转pF::GUS的拟南芥发现,pF启动子活性随着甘露醇浓度的增加启动子活性增强,在300 mmol/L甘露醇处理下启动子活性最强,是对照（未添加甘露醇）的1.67倍;转不同删切片段启动子的拟南芥用300 mmol/L甘露醇处理,发现不同片段启动子pF、p9、p6、p3的GUS蛋白酶的活性与对照（未添加甘露醇）相比,分别增加了0.69、0.90、0.26、0.84倍。结果表明,在甘露醇处理下MxMYB176启动子活性显著增强（p<0.05）,预测该转录因子在干旱胁迫诱导表达。