凝血酶适配体HD1可以控制凝血酶的活性,调控凝血过程,因有望成为生物无毒的抗栓核酸药物而被广泛关注。在凝血酶适配体HD1基础上,产生的重复序列HD1凝血酶适配体和二价凝血酶适配体（HD1序列与HD22序列串联）,有望进一步增强结合效率和拓展应用领域。从单分子水平上对这些凝血酶适配体的行为进行研究,有利于揭示它们的作用机制,为更好的设计核酸药物或传感器提供理论依据。基于磁镊的单分子力谱技术在微小力控制方面具有超强的稳定性,为在长时间尺度下操控和研究核酸与蛋白质的相互作用提供了有力的工具。本论文在第一章中,详细地介绍了磁镊单分子力谱技术,包括磁镊的构造及原理、工作过程和数据的获得与分析、单分子拉伸的获得与判断标准、磁镊力值校正方法。在接下来的章节中以磁镊单分子力谱为主要表征手段,以研究单个凝血酶适配体及其衍生物的高级结构、力学稳定性、折叠动力学和各结构单元的协同工作机制等为目标,开展了以下四方面的工作。在本论文第二章中,利用共价偶联和双指数函数力值校正等方法,构建了基于磁镊的单分子操纵及测量系统,为本论文的研究工作奠定了基础。本章以2700bp双链DNA和八聚GB1蛋白为模型体系,对共价偶联方法、磁镊的力精度和空间分辨率进行验证:共价偶联后体系稳定性明显提高,可以实现对DNA和蛋白质的连续稳定操控;利用双指数函数力值校正法对磁镊力值进行校正,并利用B-S转变和八聚GB1蛋白解折叠指纹谱证明体系构建与校正的准确性;同时利用力学指纹谱证明磁镊空间分辨率的准确性;通过检测GB1蛋白质的折叠/解折叠过程,证明磁镊系统在微小力操控方面的优势。在论文第三章中,分别以HD1单体和HD1二倍体为模型体系,研究了凝血酶适配体折叠/解折叠过程,并且首次发现了棒状凝血酶适配体。本章首先将两段dsDNA把手与HD1单体和HD1二倍体相连构建了dsDNA-ssDNA-dsDNA体系。通过对比HD1单体和HD1二倍体的单分子解折叠方式,首次发现二倍体HD1凝血酶适配体中的“棒状适配体”结构,而且凝血酶的存在有利于棒状适配体结构的形成。另外,利用磁镊对HD1单体孵育时间-折叠概率关系的研究表明,HD1结构的折叠速率体现出类似对数增长的特征:在0-30 s内快速增长;30 s后增长速度逐渐变缓,60 s后折叠概率趋近于饱和。在论文第四章中,以重复序列HD1为模型体系,研究了拷贝数、间隔基长度和凝血酶对棒状适配体结构的影响。首先本章发展了换酶滚环扩增合成法（PC-RCA）,合成了在5’和3’末端都具有活性官能团的长单链重复序列DNA。通过长单链重复序列HD1的磁镊力谱与原子力显微镜成像实验进一步证明了重复序列HD1中“棒状适配体”结构的存在。重复序列中出现了尺寸较大的棒状凝血酶适配体,这一现象可能用于解释人体内重复序列拷贝数异常疾病（例如亨廷顿病等）的病因;间隔基的增长能够赋予重复单元间更大的自由度,进而提高了棒状凝血酶适配体形成的概率,且没有影响其力学稳定性;凝血酶能够与棒状凝血酶适配体结合,并会促进棒状适配体的形成。在论文第五章中,以核酸药物HD1-T₁₅-HD22为模型体系,研究了核酸药物中两个结构域典型的协同工作机制和失效机制。本章将两段dsDNA把手与HD1-T₁₅-HD22相连构建了dsDNA-ssDNA(HD1-T₁₅-HD22)-dsDNA体系。利用单分子力谱研究了核酸药物两个结构域的形成与破坏过程,并通过HD1和HD22完全解链长度的差异对各组分的动力学行为进行区分。在此基础上,本文进一步研究了该药物中两个结构域与靶蛋白凝血酶的典型协同工作与失效机制。为研究高性能抗血栓核酸药物的设计与优化提供了理论依据,并开创了一种新的研究核酸药物与靶标（小分子/蛋白/病毒等）相互作用的普适方法。