肝纤维化是对慢性肝病的典型应答,以大量的细胞外基质沉积为病理特征,是肝硬化的早期阶段。当慢性或反复的肝脏炎症刺激因素被去除后,肝纤维化可以逆转。巨噬细胞是肝脏内重要的固有免疫细胞,对维持组织体内平衡和对肝脏损伤做出快速反应具有关键作用。研究发现,枯否细胞对肝星状细胞的功能及基质胶原的分解具有调控作用,能双向调节肝纤维化的形成和逆转。巨噬细胞能随周围微环境改变而迅速极化成不同的表型及功能,是其在肝纤维化过程发挥作用的基础。巨噬细胞功能与其表型密切相关,按目前推荐的巨噬细胞分型命名,M（LPS）型及M（IL-4）型分别对应于之前的M1和M2分型。M（LPS）型巨噬细胞在各种慢性炎症性疾病起着关键的致炎作用。相反,M（IL-4）型巨噬细胞具有抗炎及促修复作用。M（LPS）/M（IL-4）表型失衡是慢性炎症性疾病发病机制的关键环节。那么,通过限制M（LPS）型巨噬细胞的极化,同时/或促进M（IL-4）型巨噬细胞的表达是否可以减轻炎症及促进组织修复?是本文将探讨的问题。白藜芦醇是一种存在于花生、葡萄和浆果等的天然多酚类黄酮,具有多种生物活性。既往研究表明,白藜芦醇对肝损伤和纤维化具有改善的作用。然而,是否白藜芦醇的抗纤维化作用与肝脏巨噬细胞表型转化相关?如果相关,其信号通路如何?目前罕有相关报道。为进一步了解白藜芦醇在抗肝纤维化作用的机制,并阐明巨噬细胞表型转化对肝纤维化的影响,以探索治疗肝纤维化的新靶点,本研究应用CCL₄诱导肝纤维化小鼠模型和RAW264.7巨噬细胞,观察肝脏巨噬细胞极化对肝纤维的影响,并探寻其作用机制。本研究将从以下三方面进行研究:第一部分白藜芦醇通过促进枯否细胞表型转化改善四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的实验研究目的:构建CCL₄肝纤维化小鼠模型,观察分析小鼠肝纤维化发病过程中M（LPS）型及M（IL-4）型枯否细胞之间的关系,探讨肝纤维化模型肝脏中M（LPS）/M（IL-4）型枯否细胞的极化及平衡对肝纤维化形成的影响及机制。方法:健康雄性BALB/C小鼠18只（6⁸周龄）,体重20²2克,随机分为:正常对照组（n=6）、CCL₄肝纤维化模型组（n=6）、白藜芦醇干预组（CCL₄+白藜芦醇组）（n=6）,干预4周。H&E和Masson染色及Ishak、METAVIR评分系统、羟脯氨酸测定判定肝纤维程度;QRT-PCR检测肝组织M（LPS）型巨噬细胞相关基因:iNOS、TNF-α、MCP1、IL-1β表达,M（IL-4）型巨噬细胞相关基因:Mrc1、Mrc2、Arg1、CD163表达,以及IL-10基因表达;免疫组化法检测肝组织iNOS及CD206标志物;TUNEL与iNOS双染法检测肝组织M（LPS）型枯否细胞凋亡情况。结果:（1）H&E、Masson染色、羟脯氨酸测定、Ishak和METAVIR评分结果提示白藜芦醇可显著改善CCL₄诱导的小鼠肝纤维化;（2）白藜芦醇干预组F4/80基因表达显著增高,提示白藜芦醇促进枯否细胞参与组织修复过程;（3）与CCL₄组比较,白藜芦醇干预组M（IL-4）标志:Arg1、CD163、Mrc1、Mrc2基因表达显著增高（P<0.05）,而M（LPS）型标志物iNOS下降（P<0.05）,TNF-α及MCP1轻微下降（P>0.05）,IL-1β基因表达增高（P<0.05）。免疫组化及免疫荧光染色结果提示,与CCL₄组比较,白藜芦醇干预组M（IL-4）标志物CD206表达显著增高（P<0.05）,而M（LPS）标志物iNOS表达显著下降（P<0.05）。以上结果提示:白藜芦醇促进枯否细胞M（LPS）型向M（IL-4）-样表型转化,但仍有M（LPS）型标志物表达。（4）白藜芦醇干预组IL-10基因表达显著高于CCL₄组（P<0.05）,提示白藜芦醇促进内源性IL-10基因表达。（5）TUNEL与iNOS免疫组化双染结果提示,白藜芦醇干预组M（LPS）型枯否细胞凋亡率高于CCL₄组（P<0.05）,提示白藜芦醇促进M（LPS）型枯否细胞凋亡。结论:白藜芦醇对CCL₄诱导的小鼠肝纤维化改善作用可能是通过促进巨噬细胞内源性IL-10表达及促进M（LPS）型枯否细胞凋亡,使周围微环境向抗炎反应性方向转变,促使M（LPS）型枯否细胞向M（IL-4）-样表型转化,从而促进组织修复。第二部分M2诱导剂调控M（LPS）型巨噬细胞表型转化的体外实验研究目的:通过体外实验验证M2型诱导剂及M2型条件培养基对M（LPS）型巨噬细胞细胞的再极化作用。方法:1.诱导M（LPS）型、M（IL-4）型Raw264.7极化:各组Raw264.7细胞首先在加有10%FBS血清的DMEM培养基中增殖18小时后,再予无血清培养24小时,之后分组如下:（1）对照组:DMEM+不加刺激物;（2）LPS组:DMEM+LPS（1ug/ml）;（3）IL-4组:DMEM+IL-4（5ng/ml）;（4）白藜芦醇组:DMEM+白芦藜醇（30μM）,各组均刺激24小时。QRT-PCR法检测巨噬细胞标志物M（LPS）型标志物:iNOS、TNF-α、MCP1;M（IL-4）标志物Mrc2、Mrc1、Arg1 mRNA表达水平以及IL-10 mRNA水平。共聚焦显微镜免疫荧光双染检测iNOS及CD206表达情况。2.M2型诱导剂及条件培养基对M（LPS）型巨噬细胞的作用:（1）Raw264.7细胞予LPS（1ug/ml）刺激24h,获得M（LPS）型Raw264.7。（2）予M2诱导剂IL-4或白藜芦醇及其条件培养基干预M（LPS）型Raw264.7。i获取M2型条件培养基:从对照组、LPS刺激组、IL-4刺激组、白藜芦醇刺激组收集培养基并离心,去除细胞及细胞碎片成分以获得M1或M2型条件培养基（conditioned medium,CM）。,ii将M（LPS）型Raw264.7分别加入（1）M（LPS）+无血清DNEM;（2）M（LPS）+LPS（1ug/ml）;（3）M（LPS）+白藜芦醇（30uM）;（4）M（LPS）+IL-4（5ng/ml）;（5）M（LPS）+空白培养基CM;（6）M（LPS）+IL-4 CM;（7）M（LPS）+白藜芦醇CM;（8）M（LPS）+LPS CM,分别刺激6h、24h。（3）QRT-PCR检测巨噬细胞标志物M（LPS）型标志物:iNOS、TNF-α、MCP1、IL-1β;M2标志物Mrc1、Mrc2、TGF-β基因表达水平以及IL-10基因表达水平。（4）共聚焦显微镜免疫荧光双染观察CD206、iNOS表达情况。（5）细胞A0-PI双染、HO-PI双染、TUNEL染色检测细胞凋亡情况。结果:（1）经用M（LPS）型诱导剂LPS（1ug/ml）诱导24h后,M（LPS）型标志iNOS呈高表达;经用M（IL-4）型诱导剂IL-4（5ng/ml）、白芦藜醇（30uM）刺激RAW264.7巨噬细胞24h后M（IL-4）标志物Mrc1、Mrc2呈高表达;共聚焦显微镜免疫荧光双染结果:经LPS（1ug/ml）刺激RAW264.7巨噬细胞24h后,M（LPS）型标志物iNOS高表达;经用M2型诱导剂IL-4（5ng/ml）、白芦藜醇（30uM）诱导24h后,M（IL-4）型标志物CD206高表达。提示:LPS能诱导RAW264.7巨噬细胞细胞向M（LPS）分化,而IL-4和白藜芦醇能诱导其向M（IL-4）方向分化。（2）M（LPS）型Raw264.7给予M2型诱导剂及M2型条件培养基共培养6h后,M（LPS）型标志物:iNOS mRNA表达下降,而TNF-αmRNA及MCP1 mRNA表达未见明显抑制,IL-1βmRNA表达增高;M（IL-4）型标志物:Mrc1 mRNA表达增加;IL-10 mRNA在M（LPS）+LPS组、M（LPS）+IL-4组及M（LPS）+Res CM组均增高。共聚焦显微镜免疫荧光双染结果:予M2诱导剂IL-4或白藜芦醇及其条件培养基干预M（LPS）型Raw264.7细胞后iNOS表达下降,而CD206表达增强。提示:M（LPS）型RAW264.7予M2型诱导剂及其CM干预后,M（LPS）型RAW264.7向M（IL-4）-样细胞分化,但仍表达M（LPS）相关标志。（3）细胞A0-PI双染、HO-PI双染、TUNEL染色结果提示:IL-4、白藜芦醇及CM促进M（LPS）型Raw264.7细胞凋亡。结论:与体内实验结果一致,在炎症反应条件下,M2诱导剂IL-4及白藜芦醇可以通过促进巨噬细胞内源性IL-10的表达及促进M（LPS）型巨噬细胞凋亡,使周围微环境从促炎向抗炎反应方向转变,从而诱导M（LPS）型巨噬细胞向M（IL-4）-样表型分化,促进了炎症反应修复过程。第三部分M2诱导剂通过调控NF-κB1促进巨噬细胞M（LPS）型向M（IL-4）-样转化目的:探寻M2诱导剂促进巨噬细胞M（LPS）型向M（IL-4）-样细胞转化的信号通路。方法:（1）体内实验:健康雄性BALB/C小鼠18只（6⁸周龄）,体重20²2克,随机分为:正常对照组（n=6）、CCL₄肝纤维化模型组（n=6）、白藜芦醇干预组（CCL₄+白藜芦醇组）（n=6）,干预4周。实时荧光定量PCR检测肝组织TLR4、TLR2、MYD88、ERK、C-maf、NF-κB1、NF-κB p65、IL-10、IL-1β、TNF-α基因表达情况。（2）体外实验:Raw264.7细胞予LPS（1ug/ml）刺激24h,获得M（LPS）型Raw264.7。予M2诱导剂IL-4或白藜芦醇及其条件培养基干预M（LPS）型Raw264.7,分组如下:（1）M（LPS）+无血清DNEM;（2）M（LPS）+LPS（1ug/ml）;（3）M（LPS）+白藜芦醇（30uM）;（4）M（LPS）+IL-4（5ng/ml）;（5）M（LPS）+空白培养基CM;（6）M（LPS）+IL-4 CM;（7）M（LPS）+白藜芦醇CM;（8）M（LPS）+LPS CM,分别刺激6h。通过荧光定量RT-PCR检测细胞及肝组织中转录因子TLR4、TLR2、MYD88、ERK、C-maf、NF-κB1、NF-κB（p65）、IL-10、IL-1β、TNF-α基因表达情况。结果:（1）体内实验结果提示:白藜芦醇干预组小鼠肝脏TLR4、TLR2、MYD88、ERK基因表达增高;NF-κB1与IL-10基因表达同步增加;白藜芦醇干预组小鼠肝脏C-maf基因表达与IL-10基因表达显著增加。（2）体外实验结果提示:与体内动物实验结果吻合,M2诱导剂及其条件培养基干预M（LPS）型RAW264.7细胞后,C-maf、NF-κB1、ERK、IL-10mRNA表达增高。结论:（1）炎症反应条件下,白藜芦醇可能通过促进巨噬细胞NF-κB1转录因子的表达,从而增强了对TLRs-MYD88-ERK-IL-10信号通路的调控作用,促进巨噬细胞内源性IL-10的表达,使体内微环境从促炎向抗炎修复反应方向转化,促使M（LPS）型巨噬细胞向M（IL-4）-样细胞极化,从而改善肝纤维化。我们的结果提示,NF-κB1对调控巨噬细胞极化具有重要作用,是抗肝纤维化治疗的潜在作用靶点。（2）白藜芦醇也可能通过促进C-maf基因转录,使内源性IL-10表达增加,促使M（LPS）表型向M（IL-4）-样细胞转化,从而促进炎症修复过程。因此,C-maf可能是调控巨噬细胞极化及抗肝纤维化治疗的另一潜在靶点。