根据流行病病学和病因学研究发现,在人类恶性肿瘤中,膀胱癌的发病率居第九位,且在男性排名第六位,女性排在第十位之后。而在中国,男性的发病率在恶性肿瘤中居第八位,女性则排在十二位之后。膀胱癌可发生于任何年龄,甚至可见于儿童,但主要是中年。膀胱癌的发病因素复杂,主要包括遗传和环境两大类。组织学上,膀胱癌包括尿路上皮(移行)细胞癌、鳞状细胞癌和腺细胞癌,其次还有少见的小细胞癌,混合型,癌肉瘤及转移性癌。其中膀胱尿路上皮细胞癌占90%以上。microRNA(简称miRNA)又称微小RNA,是真核生物细胞中固有的一类不编码蛋白的小分子,长度为18-25nt,能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译,从而实现对基因进行转录后表达的调控。通过抑制下游靶基因的表达而发挥其生物学功能。miRNA可调节肿瘤细胞增殖和凋亡的过程,能够参与细胞自我更新和分化过程。可作为生物标记物,应用于肿瘤诊断、预后评估和靶向治疗。有些miRNA分子还可作为原癌基因或抑癌基因调控肿瘤。文献报道,在膀胱尿路上皮细胞癌中,microRNA的测序时发现hsa-mir-96在膀胱尿路上皮癌中高表达。本研究采用RT-PCR, Western Blot等方法来初步探讨hsa-mir-96在膀胱尿路上皮癌细胞生长中的分子机制,为进一步的信号通路研究作出预测。第一章hsa-mir-96在膀胱尿路上皮细胞癌中高表达的验证目的：探讨并验证hsa-mir-96在膀胱尿路上皮细胞癌中的表达及意义方法：采用Real-time PCR方法验证33例膀胱尿路上皮细胞癌及9例癌旁正常膀胱组织中hsa-mir-96的表达情况,并分析其与膀胱尿路上皮细胞癌病理分级及临床分期的关系。结果：hsa-mir-96在膀胱尿路上皮细胞癌中的表达明显高于癌旁正常膀胱组织(P<0.01)。其表达与膀胱尿路上皮细胞癌的病理分级、临床分期密切相关,随病理分级、临床分期的增高而其表达也升高。结论：1.膀胱尿路上皮细胞癌组织中hsa-mir-96的表达高于癌旁正常膀胱组织。2.膀胱尿路上皮细胞癌组织中hsa-mir-96的表达与其病理分级明显正相关。3.膀胱尿路上皮细胞癌临床分期与hsa-mir-96的表达呈正相关,4. hsa-mir-96在膀胱尿路上细胞癌的发生、发展过程中起重要作用。可能作为原癌基因来调控膀胱尿路上皮细胞癌。第二章hsa-mir-96对膀胱尿路上皮细胞癌细胞株生物学行为的影响第一节筛选工具细胞及靶基因根据hsa-mir-96在膀胱细胞癌株的表达情况,筛选出高表达的细胞株作为工具细胞。目的：比较hsa-mir-96在膀胱细胞癌细胞株T24和5637细胞中的表达,筛选出作为细胞水平实验的工具细胞。同时检测靶基因IRS1、MAP4K1、MAP2K2、MAP3K3、MAP4K4在癌细胞株的表达,挑选其中三个相对含量表达高的靶基因进入下游实验。方法：(1)选两株膀胱癌细胞：T24和膀胱肿瘤细胞株5637,采用Real-time PCR方法检测hsa-mir-96在两株细胞中的表达,确定表达丰度合适的适用于进行干扰实验的细胞株,并结合细胞的增殖和分化特征,作为细胞水平实验的工具细胞,同时采用半定量RT-PCR检测两株细胞中靶基因IRS1及MAP3K(MP4K1、MAP2K2、MAP3K3、MAP4K4)的相对含量表达。以上靶基因通过基因预测软件：miRBase, TargetScan)及Microrna综合所得,选择其中三个表达相对含量高的靶基因进入下游实验。结果：hsa-mir-96在膀胱癌细胞株T24细胞中的表达明显高于5637细胞(p<0.01)。在T24细胞及5637细胞中,IRS1、MAP4K1MAP2K2的相对R值较MAP3K3、MAP4K4高(相对R值是目的基因相对IOD值/内参基因相对IOD值)。结论：1. hsa-mir-96在T24细胞中表达较5637细胞有显著性差异,故选择T24细胞作为下游实验的工具细胞。2.在T24细胞及5637细胞中,IRS1、MAP4K1、MAP2K2的R值较MAP3K3、MAP4K4高,故选择此3基因作为hsa-mir-96的靶基因。3.上述结果可知：IRS1、MAP4K1、MAP2K23个基因在T24细胞中表达高,故选择此3基因和T24细胞进行下游实验。4.通过对靶基因的验证,提示了通过预测软件所得的靶基因,存在假阳性。第二节hsa-mir-96对膀胱细胞癌株T24细胞生物学行为的影响目的：探讨hsa-mir-96对膀胱细胞癌株T24细胞增殖、凋亡及侵袭能力等生物学行为的影响方法：1、构建hsa-mir-96抑制剂及microRNA阴性片段,并转染到T24细胞中,采用定量PCR检测,确认转染是否成功。2、MTT法检测细胞的存活率,并绘制T24细胞的生长曲线图。3、AV/PI双标法FCM检测T24细胞的凋亡情况。4、细胞侵袭实验观察hsa-mir-96对T24细胞浸袭能力的影响。5、细胞分三组：A正常培养T24细胞；B microRNA阴性对照组：T24细胞+microRNA阴性片段；C hsa-mir-96抑制组：T24细胞+hsa-mir-96抑制剂片段结果：1.构建hsa-mir-96抑制剂及microRNA阴性片段,转染到T24细胞,细胞的转染效率达到80%以上可以进行后续的检测。2.转染48小时后的T24细胞,生长速度较对照组明显减慢,差异有统计学意义(p<0.01)。3.转染48小时后的T24细胞凋亡率较对照组明显增加(p<0.01)。4.细胞侵袭实验观察到转染48小时后的T24细胞侵袭能力减弱(p<0.01)。结论：1. hsa-mir-96抑制剂能抑制T24细胞的生长。2. hsa-mir-96抑制剂促进T24细胞的凋亡。3. hsa-mir-96抑制组细胞的侵袭能力降低。第三章hsa-mir-96信号转导通路的研究目的：根据hsa-mir-96靶基因在T24细胞的表达情况,初步探讨hsa-mir-96与靶基因的相互作用的关系,进一步研究hsa-mir-96在膀胱尿路上皮细胞癌中的信号转导通路。方法：1.采用Real-time PCR检测三基因(IRSI、MP4K1、MAP2K2)在T24细胞的表达情况。2.采用Western-blot检测三基因的蛋白含量变化。3.细胞分三组：A正常培养T24细胞；B microRNA阴性对照组：T24细胞+microRNA阴性片段；C hsa-mir-96抑制组：T24细胞+hsa-mir-96抑制剂片段结果：1. Real-time PCR结果发现结果显示IRSI及MP4K1在3组细胞表达变化明显(P<0.01),而MAP2K2在三组的表达相对含量无明显变化。2. Western-blot结果显示IRIRSI及MP4K1在3组细胞表达变化明显,而MAP2K2在三组的表达相对含量无明显变化(P>0.05)。结论：1.IRS1在抑制剂组的表达与正常对照组及阴性对照组比较,明显降低,有显著的差异性。2.MP4K1在抑制剂组的表达较正常对照组及阴性对照组降低,有显著的差异性。3.MAP2K2在三组细胞中的相对含量及蛋白表达无变化,不能作为hsa-mir-96的靶基因,IRS1、MP4K1可作为hsa-mir-96的靶基因,与hsa-mir-96在膀胱尿路上皮细胞癌中共同发挥作用。