脑血管病是我国居民死亡的第一原因和成人残疾的第一原因，以缺血性脑血管病最为常见，具有发病率高、病死率高、致残率高、复发率高、恢复缓慢的特点。缺血后继发性脑损伤是患者的病情加重和影响预后的重要原因。近年来，脑缺血后脑损伤的病理生理机制研究已取得了重大进步，然而，临床治疗效果却非常有限。脑梗死后的继发性脑损伤常导致病情加重，主要包括氧化应激、炎症反应、凋亡、细胞内钙超载、细胞毒性作用、活性氧及自由基等，这几种因素之间相互作用、相互影响，构成复杂的调控网络，形成恶性循环，造成一系列病理级联反应，其中过度炎症反应、氧化应激和凋亡存在于脑梗死后坏死和缺血区域，成为导致继发损伤的主要原因。因此，抗氧化应激、减轻炎症损伤、抑制凋亡成为治疗脑梗死的主要途径之一。木犀草素（Luteolin）是一种天然黄酮类化合物，分子式为：C15H10O6，存在于多种植物中，因最初是从木犀草科（Resedaceae）木犀草属草本植物木犀草（ResedaodorataL）的叶、茎、枝中分离出而得名，具有多种药理活性，如抗炎、抗氧化、抑制凋亡、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、增强免疫功能等多种生物学作用，其毒副作用低，具有良好的临床应用潜力。本研究选用雄性Sprague-Dawley大鼠，应用改良Longa线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型。在大鼠永久性大脑中动脉阻塞所致的脑缺血模型上观察脑缺血后TLR4，TLR5，P38MAPK，ERK1/2，claudin-5，Bcl-2和Bax的表达，大脑皮层梗塞灶超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）与过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性及丙二醛（Malondiadehyde，MDA）的含量。确定缺血后与炎症反应、氧化损伤及凋亡的关系，并选用黄酮类化合物木犀草素进行干预，评价干预前后梗死体积、脑含水量、神经功能缺损评分，以及木犀草素对TLR4，TLR5，P38MAPK，ERK1/2，claudin-5，Bcl-2和Bax的表达信号通路的影响，研究木犀草素对缺血损伤后的脑保护作用机制进行初步探讨，并检测木犀草素对氧化应激标志物SOD，CAT活性和MDA含量的影响。本研究分三部分，现将各部分内容概述如下。第一部分木犀草素对实验性脑缺血大鼠的抗氧化作用及机制研究目的：观察实验性大鼠脑缺血损伤后不同时间点梗死体积、脑含水量、神经功能缺损评分，claudin-5的表达变化以及SOD，CAT的活性和MDA的含量。研究木犀草素对脑缺血大鼠的脑保护作用。探讨木犀草素抗氧化作用的相关机制。方法：选用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠为研究对象，应用改良Longa线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉梗塞模型（MCAO）。实验1：观察木犀草素的神经保护作用，梗塞后24h和72h分别观察神经功能缺损评分，脑含水量，梗塞体积。实验动物随机分为6组，假手术组（Sham），假手术后腹腔注射等量生理盐水+1%DMSO；手术组（MCAO），缺血术后腹腔注射等量生理盐水；溶剂对照组（MC+DM），缺血术后腹腔注射等量生理盐水+1%DMSO；木犀草素小剂量组（Luteolin-L），缺血术后腹腔注射木犀草素5mg/kg；木犀草素中剂量组（Luteolin-M），缺血术后腹腔注射木犀草素10mg/kg；木犀草素大剂量组（Luteolin-H），缺血术后腹腔注射木犀草素25mg/kg。实验2：观察木犀草素的抗氧化功能。检测脑组织中超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）的活性，丙二醛（MDA）含量的变化情况。实验动物随机分为5组，假手术组（Sham），手术组（MCAO），溶剂对照组（MC+DM），木犀草素中剂量组（Luteolin-M），木犀草素大剂量组（Luteolin-H）。实验3：观察脑缺血后木犀草素对血脑屏障的影响。实验动物随机分为5组，假手术组（Sham），手术组（MCAO），溶剂对照组（MC+DM），木犀草素中剂量组（Luteolin-M），木犀草素大剂量组（Luteolin-H）。各组取材前进行神经功能评分，干湿重法测定脑组织含水量，TTC染色评价脑梗死体积，分别用RT-qPCR的方法和Westernblot的方法检测缺血脑组织claudin-5mRNA和蛋白水平的变化。结果：1Sham组无神经功能缺损，神经功能缺损评分为0分；MCAO组和MC+DM组在24h和72h神经功能缺损评分均较严重，Luteolin-L组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比没有明显降低神经功能缺损，差异无统计学意义（P＞0.05），Luteolin-M组和Luteolin-H组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比均可明显降低神经功能缺损，差异有统计学意义（P＜0.05）。2Luteolin-L组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比均没有明显降低脑含水量，差异无统计学意义（P＞0.05），Luteolin-M组和Luteolin-H组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比均可明显降低脑含水量，差异有统计学意义（P＜0.05）。3Luteolin-L组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比均没有明显降低脑梗死体积，差异无统计学意义（P＞0.05），Luteolin-M组和Luteolin-H组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比均可明显降低脑梗死体积，差异有统计学意义（P＜0.05）。我们可以看到木犀草素在每天10mg/kg（Luteolin-M）和25mg/kg（Luteolin-H）时发挥更好的治疗作用，因此，下面的研究集中在10mg/kg和25mg/kg。4Western blot中，与MCAO组和MC+DM组比较，Luteolin-H组在24h和72h均可明显增加claudin-5的蛋白表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。Luteolin-M组只在72h可明显增加claudin-5的蛋白表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。与Western blot的结果一致，Luteolin-H组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比均可明显增加claudin-5的mRNA表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。Luteolin-M组只在72h可明显增加claudin-5的mRNA表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。5与MCAO组和MC+DM组比较，Luteolin-M组和Luteolin-H组在24h和72h均可明显增加SOD，CAT的活性，差异有统计学意义（P＜0.05）。与MCAO组和MC+DM组比较，Luteolin-M组和Luteolin-H组在24h和72h均可明显减低MDA的含量，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：木犀草素对局灶性脑缺血大鼠有较好的神经保护作用，可改善脑缺血损伤后的神经功能缺失，减轻脑含水量，减小脑梗死体积，诱导claudin-5的表达，增加SOD，CAT的活性，减少MDA的含量，因此我们推测木犀草素的神经保护作用可能是通过增加claudin-5的表达，提高SOD，CAT的活性，减少MDA含量实现的；这些是木犀草素发挥其抗氧化作用之一，从而实现其神经保护作用。第二部分木犀草素对实验性脑缺血大鼠的抗炎作用及机制研究目的：观察脑缺血后不同时间点TLRs/MAPKs/NF-κB的表达变化，研究木犀草素对脑缺血大鼠的抗炎作用，探讨木犀草素抗炎作用的相关信号机制。方法：选用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠为研究对象，应用改良Longa线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉梗塞模型（MCAO）。实验动物随机分为5组，假手术组（Sham），假手术后腹腔注射等量生理盐水+1%DMSO；手术组（MCAO），缺血术后腹腔注射等量生理盐水；溶剂对照组（MC+DM），缺血术后腹腔注射等量生理盐水+1%DMSO；木犀草素中剂量组（Luteolin-M），缺血术后腹腔注射木犀草素10mg/kg；木犀草素大剂量组（Luteolin-H），缺血术后腹腔注射木犀草素25mg/kg。各组取材前进行神经功能评分，分别用免疫组化，Western-blot和RT-qPCR的方法检测缺血脑组织中TLR4、TLR5、p-p38，p-ERK，NF-κB蛋白和mRNA水平的变化。结果：1缺血后24h和72h，TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的表达均有升高，而p-ERK的表达在24h时呈逐渐升高趋势，72h后逐渐降低。两种剂量木犀草素干预后均可以降低脑缺血大鼠的炎症表达。免疫组化中，与MCAO组和MC+DM组相比，Luteolin-H组在24h和72h均可明显降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的细胞数，增加p-ERK的细胞数。差异有统计学意义（P＜0.05）。Luteolin-M组只在72h与MCAO组和MC+DM组相比可明显降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的细胞数，增加p-ERK的细胞数，差异有统计学意义（P＜0.05）。2Western blot中，Luteolin-H组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比均可明显降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的蛋白表达，增加p-ERK的蛋白表达。差异有统计学意义（P＜0.05）。Luteolin-M组只在72h与MCAO组和MC+DM组相比可明显降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的蛋白表达，增加p-ERK的蛋白表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。3与免疫组化和Western blot的结果一致，Luteolin-H组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比均可明显降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的mRNA表达，增加p-ERK的mRNA表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。Luteolin-M组只在72h与MCAO组和MC+DM组相比可明显降低TLR4、TLR5、p-p38、NF-κB的mRNA表达，增加p-ERK的mRNA表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：局灶性脑缺血后，缺血脑组织的TLR4、TLR5、p-p38、p-ERK、NF-κB表达的变化过程与脑组织损伤程度一致，提示TLR4/NF-κB通路的炎症损伤参与了脑缺血损伤；木犀草素可下调TLR4、TLR5、p-p38、抑制NF-κB的核转位，上调p-ERK，从而减轻缺血脑组织的过度炎症反应，实现缺血后的神经保护作用。第三部分木犀草素对实验性脑缺血大鼠的抗凋亡作用及机制研究目的：观察脑缺血损伤后不同时间点Bcl-2/Bax的表达变化，研究木犀草素对脑缺血大鼠的抗凋亡作用，探讨木犀草素抗凋亡作用的相关信号转导机制。方法：选用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠为研究对象，应用改良Longa线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉梗塞模型（MCAO）。实验动物随机分为5组，假手术组（Sham），假手术后腹腔注射等量生理盐水+1%DMSO；手术组（MCAO），缺血术后腹腔注射等量生理盐水；溶剂对照组（MC+DM），缺血术后腹腔注射等量生理盐水+1%DMSO；木犀草素中剂量组（Luteolin-M），缺血术后腹腔注射木犀草素10mg/kg；木犀草素大剂量组（Luteolin-H），缺血术后腹腔注射木犀草素25mg/kg。各组取材前进行神经功能评分，分别用免疫组化，Western-blot和RT-qPCR的方法检测缺血脑组织中Bcl-2和Bax蛋白和mRNA水平的变化。结果：1缺血后24h和72h，Bcl-2的表达降低，Bax表达升高，免疫组化中，Luteolin-H组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比均可明显增高Bcl-2的细胞数，降低Bax的细胞数。差异有统计学意义（P＜0.05）。Luteolin-M组只在72h与MCAO组和MC+DM组相比可明显增高Bcl-2的细胞数，降低Bax的细胞数。差异有统计学意义（P＜0.05）。2Western blot中，Luteolin-H组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比均可明显增加Bcl-2的蛋白表达，降低Bax的蛋白表达。差异有统计学意义（P＜0.05）。Luteolin-M组只在72h与MCAO组和MC+DM组相比可明显增加Bcl-2的蛋白表达，降低Bax的蛋白表达。差异有统计学意义（P＜0.05）。3与免疫组化和Western blot的结果一致，Luteolin-H组在24h和72h与MCAO组和MC+DM组相比均可明显增加Bcl-2的mRNA表达水平，降低Bax的mRNA表达水平。差异有统计学意义（P＜0.05）。Luteolin-M组只在72h与MCAO组和MC+DM组相比可明显增加Bcl-2的mRNA表达水平，降低Bax的mRNA表达水平。差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：局灶性脑缺血后，缺血脑组织的Bcl-2与Bax表达的变化过程与脑组织损伤程度一致，提示Bcl-2与Bax通路参与了脑缺血损伤；木犀草素可上调Bcl-2的表达并下调Bax的表达，从而减轻缺血脑组织的过度凋亡过程，实现缺血后的神经保护作用。