论文部分内容阅读
一、研究背景:中暑（heatstroke）是一种夏季高温高湿环境常见的疾病,表现为中心体温超过40℃,而重症中暑常出现危及生命的多脏器功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）,其中以中枢神经系统功能障碍为表现最为突出。尽管救治上采取积极的降温措施并给予脏器功能保护等处理,但其死亡率仍居高不下,而且随着全球气候变暖和热浪袭击强度与频率的增加,重症中暑死亡率仍呈继续升高趋势[1]。有国外流行病学研究资料显示,2006年至2010年在美国至少有3332名患者死于中暑。有报道称重症中暑28天和2年的死亡率分别高达58%和71%,而且因为气候变化,中暑死亡人数也有所增加。到2050年代,与中暑相关的死亡人数预计将增加2000倍,约为2000人死亡的年度基线[2]。我国目前还没有系统性的流行病学调查,在我们团队前期的流行病学调查研究中发现,在我国南方地区中暑是夏季的一种常见病,尤其在军事训练中常有发生,可直接导致军事人员的减员或死亡[3]。据不完全统计,我国中暑死亡率约10-15%,其中重症中暑的死亡率可高达40%以上,在存活下来的患者中,超过30%遭受着长期神经等系统后遗症[1-2]。近年来,我单位收治大量的重症中暑患者,2010-2015年期间,共收治重症中暑患者118例,其中死亡42例,死亡率高达35.6%。中暑的病理生理学机制一方面为热暴露的直接损伤,另一方面尤为重要的是热损伤之后诱导的全身炎症反应综合征（SIRS）。这与脓毒症的发病机制——内毒素激活与诱导的失控性炎症反应,很是相似,因此中暑又被视为一种“类脓毒症”[1,4-6]。在其发生发展过程中,多种炎性细胞被激活,一系列炎性介质和细胞因子的释放,造成机体的损伤,同时激活更多的炎性细胞,释放更多的炎性介质或细胞因子,使机体损害信号进一步放大加强,形成炎症瀑布效应[4-6],其中最容易受到损伤的就是肺脏[7],因此如何抑制过度炎症反应及明确其导致肺损伤的机制成为治疗的关键。在以往国内外急性肺损伤相关研究中已表明,肺微血管通透性的改变与急性肺部炎症有着明确联系。WU WS等发现急性肺部炎症的特征在于通过局部募集和活化中性粒细胞、促炎介质、蛋白酶及活性氧/氮物种的释放,这些反应导致肺泡-毛细血管损伤、高渗透性肺水肿和肺力学改变,并导致严重的气体交换异常[8];ZHOU G等发现针对肺泡上皮屏障功能的损伤后修复及肺微血管通透性的保护作用可能是其重要的治疗机制之一[9]。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase,Sphk）是催化鞘氨醇（sphingosine,Sp）生成1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate,S1p）的主要限速酶,也是细胞增殖及存活的重要信号传导分子。Sphk在人体中表达两种亚型,即Sphk1和Sphk2,Sphk1主要表达在肺、脾和肝脏,促进细胞存活及抑制细胞凋亡,而Sphk2则在肝脏和心脏中表达丰富,其作用恰恰相反,促进细胞凋亡及抑制细胞存活。S1p及Sp均为磷脂（细胞膜的组成成分）在细胞生命活动中的代谢产物。S1p是一种生物活性的鞘脂类代谢物,由Sphk催化Sp后进一步磷酸化产生,在血小板中储藏丰富,被激活释放出来后在血清中与白蛋白、脂蛋白尤其是高密度脂蛋白结合聚集。S1p具有多种生物学功能,既是细胞内信号转导的第二信使,又可分泌到细胞外直接与细胞膜表面的S1p受体（S1pR）结合,发挥广泛的生物学效应,如调节细胞增殖、分化、凋亡、介导血管生成、炎症反应等[10]。由此,Sphk信号通路与多种疾病的发生发展过程相关,并在其中起重要作用。生理情况下,鞘磷脂常被认为是膜的结构性成分,然而目前的研究认为鞘磷脂为一多效应分子参与了多种细胞功能的调控[11]。新近的研究热点聚焦于探讨鞘磷脂在炎症反应和炎症疾病中的作用,这种炎症反应的调控通常认为主要是由其衍生物S1p所介导的[11]。众多研究发现Sphk1/S1p通路在调控炎症和免疫反应中发挥重要的作用[12-13]。已有研究认为多种促炎症因素包括内毒素、炎症介质/细胞因子可激活机体循环和脏器组织中的炎症细胞Sphk1活性,而阻断Sphk1表达或抑制其活性可抑制炎症细胞分泌多种炎症介质,减轻机体脏器炎症损伤[11-12]。体内外实验均证实Sphk1是多种急慢性炎症反应发生所必需的分子基础[11,13]。Puneet等2010年发表在Science杂志的研究结果表明体外内毒素刺激人类中性粒细胞和单核细胞后,Sphk1表达水平明显升高且其活性明显增加更为重要的是采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）静默Sphk1表达或使用特异性抑制剂DMS降低Sphk1的活性后可明显降低炎症细胞NF-κB活性进而减少细胞因子如TNF-a、IL-1β和IL-6及HMGB1的分泌[14]。Bryan J等在S1p对肺血管屏障完整性的体内外调节机制的研究表明S1p给药在调节急性炎性肺损伤水肿形成中影响深刻,其中血管通透性增加是肺损伤标志性特征[15]。综上所述,Sphk1/S1p参与了内毒素激活炎症细胞过程,是脓毒症炎症细胞参与炎症反应的重要分子机制,且Sphk1/S1p信号通路的活化也是急性肺损伤中微血管内皮细胞通透性改变而导致肺部炎症反应的重要分子机制,其可能有望成为一新的重症中暑急性肺损伤的有效治疗靶点。二、研究目的:本研究着眼于重症中暑继发于热损伤之后的全身炎症反应综合征（SIRS）这一根本发病机制入手,而其诱导的多脏器功能障碍综合征（MODS）中最容易受到损伤的就是肺脏,同时基于重症中暑炎症细胞是全身炎症反应产生的细胞基础这一重要病理机制,探讨重症中暑急性肺损伤中的可能分子机制。通过体内和体外展开实验,从细胞和动物多水平、多个层面探讨Sphk1/S1p是否为重症中暑肺微血管内皮细胞通透性改变而诱导炎症细胞功能激活进而启动肺损伤的分子机制;同时作为重症中暑肺损伤的有效治疗靶点。本研究可进一步阐明重症中暑肺损伤形成的病理生理机制,为下一步开展开发重症中暑救治提供有效防治靶点。三、研究内容:[1]制备重症中暑动物模型,以热打击复温后0h、6h、12h为节点,以及健康C57BL/6小鼠对照组,观察重症中暑发生发展过程中各组小鼠肺组织干湿重比、肺泡灌洗液中蛋白含量、细胞总数以及中性粒细胞百分比改变情况,检测各组小鼠肺组织中Sphk1mRNA、蛋白表达以及活性改变情况;[2]基于动物水平,建立以下对照模型:健康小鼠对照组、对照+Sphk1抑制剂DMS组、热打击组、热打击+生理盐水组、热打击+Sphk1抑制剂DMS组,观察重症中暑发生发展过程中各组小鼠肺组织干湿重比、肺泡灌洗液中蛋白含量、细胞总数以及中性粒细胞百分比改变情况,并记录各组小鼠的生存时间,分析其统计学意义;[3]基于细胞水平,体外模拟重症中暑病理生理过程,建立热联合内毒素双重打击肺微血管内皮细胞细胞（MPMEC）模型,分离及鉴定肺微血管内皮细胞;检测内皮细胞的存活率（CCK8）,观察内皮细胞通透性（TEER）的改变,检测紧密连接蛋白（ZO-1）及闭合蛋白（Occludin）表达水平的变化;分别检测内皮细胞SphK-1和Sphk-2的mRNA、蛋白表达以及活性水平的变化,同时分别检测S1pR1、S1pR2、S1pR3的mRNA、蛋白表达以及活性水平的变化,并分析内皮细胞Sphk1亚型及S1p受体亚型的表达水平和活性与其细胞活性状态的相关性;采用Sphk1抑制剂DMS干扰内皮细胞活性,观察内皮细胞的活力、其通透性（TEER）、以及ZO-1和Occludin蛋白表达的恢复水平;[4]综合以上研究,评价Sphk1/S1p是否为重症中暑肺损伤发生发展过程的分子机制并作为重症中暑的候选治疗靶点。四、结果:1、动物实验发现,热打击导致了小鼠肺组织干湿重比呈复温时间依赖性增高,肺泡灌洗液中蛋白含量、细胞总数以及中性粒细胞百分比呈复温时间依赖性增高;且热打击导致了小鼠肺组织中Sphk1mRNA、蛋白表达以及活性呈复温时间依赖性增高;使用Sphk1抑制剂DMS预处理动物,可以明显减轻重症中暑小鼠肺组织中干湿重比,肺泡灌洗液中蛋白含量、细胞总数以及中性粒细胞百分比。2.通过对比观察各组小鼠生存率发现,对照组以及对照+DMS组小鼠48h内全部存活;HS组小鼠在48h内全部死亡,死亡率100%,其中大部分小鼠在24h内死亡,中位生存时间为19.5h;HS+NS组小鼠48小时内的死亡率为100%,中位生存时间为20h;HS+DMS组小鼠48小时内的死亡率为75%,其中大部分小鼠在24-48h内死亡,中位生存时间为30h。Log-rank法各组生存率的比较,得到χ2=43.27,P<0.0001,差异有统计学意义;3.细胞实验发现,热联合LPS诱导小鼠肺微血管内皮细胞（MPMECs）存活率（CCK8）明显下降,细胞通透性（TEER）增加,紧密连接蛋白（ZO-1）及闭合蛋白（Occludin）表达降低;热联合LPS诱导肺微血管内皮细胞SphK-1 mRNA、蛋白表达以及活性水平明显升高,但对SphK-2 mRNA、蛋白表达以及活性水平没有明显影响;热联合LPS诱导肺微血管内皮细胞S1pR3 mRNA、蛋白表达水平明显升高,对S1pR1以及S1pR2 mRNA、蛋白表达水平没有明显影响;4.进一步实验使用Sphk1特异性抑制剂DMS预处理小鼠MPMECs,发现DMS可明显减轻细胞损伤（通透性改变）,主要表现为促进细胞活力的恢复、改善内皮细胞的通透性、TEER恢复,以及ZO-1、Occludin蛋白表达恢复;五、结论:Sphk1-S1p-S1pR3信号通路的激活可以促进重症中暑小鼠肺部炎症反应的发生发展过程,其机制可能与增加肺微血管内皮细胞的通透性有关。