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在机体抗肿瘤免疫中,特异性细胞免疫应答在控制早期肿瘤细胞生长和转移中有重要作用,尤其是CD8<'+>CTL,它可识别肿瘤细胞表面被MHC-I类分子提呈的抗原肽,从而杀伤肿瘤细胞.将编码MHC-I类分子的重链、β2微球蛋白(β2microglobulin,β2m)及肿瘤相关抗原肽的DNA序列,用接头(linker)相连接,并折叠形成MHC-I类分子一抗原肽单链三聚体(single-chain trimer,SCT).用该三聚体来研制的抗肿瘤DNA疫苗能有效地维持其共价结构,并可以稳定地将抗原肽提呈在细胞表面,有效地激活抗原特异性的CD8<'+>CTL,从而能更有效地杀伤、清除恶性肿瘤细胞,发挥抗肿瘤作用.
研究发现,恶性肿瘤的生长、浸润和转移必须依靠肿瘤新生血管提供足够的营养,肿瘤血管生成抑制策略就是一种以阻止和减少肿瘤组织血管生成为目的的治疗方法.该治疗策略有其独特的优点,具有一定的广谱性,且不易产生耐药性,相对于细胞毒性药物具有较高的特异性.血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)与表达在血管内皮细胞上的相应受体VEGFR-2(Vascularendothelial growth factor receptor 2),又称为KDR(kinase insert domain-containingreceptor)结合所引起的信号转导是血管生成中的限速步骤,在整个血管生成中发挥着关键作用.因此,VEGF及其受体VEGFR-2成为肿瘤血管生成抑制策略的重要靶点.若能通过某种途径打破对VEGFR-2的自身免疫耐受,诱导产生针对VEGFR-2的免疫应答,破坏表达VEGFR-2的血管内皮细胞,无疑是抗肿瘤血管生成治疗最经济、最有效的方法.
迄今,已经发现三种H-2D<'b>限制性的KDR表位,即KDRl、KDR2和KDR3.其中KDR2与H-2D<'b>亲和力最高,且最易被提呈到细胞表面,从而更有效打破自身免疫耐受,诱导CD8<'+>CTL应答,对内皮细胞产生杀伤作用.因此,选择KDR2Qin Liu,Institute.of Immunology,Zhejiang University,Hangzhou,310058作为抗肿瘤血管生成治疗的靶点较其他表位更为理想.本课题旨在构建表达小鼠VEGFR-2抗原肽的SCT,为进一步研究其抗肿瘤活性及其开发研究打下基础.
目的：构建以小鼠血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)为抗原肽的MHC.I类分子-抗原肽单链三聚体(SCT)真核表达质粒peDNA3.1(+)/VEGFR-2-β2m-H-2D<'b>.
方法：SCT的构建
(1)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成编码Linker-1,Linker-2以及带有p2m信号肽的KDR2抗原肽的DNA片段.
(2)以RT-PCR法,从C57BL/6小鼠脾组织克隆H2-D<'b>及p2m的eDNA.
(3)将将带有fhm信号肽的KDR2抗原肽、p2m及H-2D<'b> DNA片段分别用Linker-1,Linker-2相连,并插入peDNA3.1(+)的多克隆位点中,构建成peDNA3.I(+)/VEGFR-2-β2m-H-2D<'b>真核表达质粒.
结果：将所构建的pcDNA3.1/132m和peDNA3/1/β2m信号肽-抗原肽-Linker-1-β2m基因重组质粒进行酶切鉴定和测序分析,结果与预期一致.将pcDNA3.1/Linker-2重组质粒进行酶切鉴定,结果与预期一致,表明peDNA3.1/Linker-2质粒构建成功.RT-PCR扩增H-2D<'b>基因片段经琼脂糖凝胶电泳和测序分析,结果与预期一致,表明成功扩增出H-2D<'b>片段.
结论：成功构建了peDNA3.1/β2m、peDNA3.1/Linker-2和peDNA3.1/β2m信号肽.抗原肽.Linker-1-β2m重组质粒,并成功扩增出H-2D<'b>片段.