细菌能准确感知周围环境条件如营养、压力、温度、渗透压、PH等的变化并能充分进行回应,这种能力对细菌的生存至关重要。而在这个过程中起重要的信号转导作用的是细菌的第二信使分子。近年来,环二核苷酸作为一类重要的第二信使分子被人们越来越广泛认知。研究发现细菌体内的环二核苷酸(c-di-GMP以及c-di-AMP)能调控包括细菌的移动性、毒性、细菌大小、细胞壁稳态以及生物被膜的形成等在内的许多细菌的生理活动,同时在感染宿主过程中能作为激活剂结合STING后诱导宿主Ⅰ型干扰素(IFNs)的应答。本论文第一部分主要对结核分枝杆菌中降解c-di-AMP的酶Rv2837c进行结构生物学以及生理生化酶活分析。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)属于革兰氏阳性菌,是引起结核病的胞内病原菌,结核病至今仍为世界上重要的传染病之一。到目前为止对于结核分枝杆菌的了解仍很有限,因此关于它的研究在结核病的预防以及治疗性疫苗的研发中非常重要。和一些革兰氏阳性病原菌相似,结核分枝杆菌胞内也存在c-di-AMP信号分子调控系统。CnpB(即Rv2837c)具有降解c-di-AMP的磷酸二酯酶活性,对结核分枝杆菌胞内c-di-AMP水平的稳定是必不可少的,同时cnpB的敲除菌株进行感染巨噬细胞及活体小鼠实验时,敲除菌株诱导巨噬细胞Ⅰ型干扰素的产生比野生型增强了十倍,且感染小鼠的毒性减弱。同时Rv2837c作为单DHH-DHHA1结构域蛋白,早在2012年就被报道作为NrnA家族蛋白可以发挥多种功能:既可以作为Orn同源类蛋白降解nanoRNA(RNA oligos ≤5 nucleotides),又可以发挥 CysQ 功能将 pAp 去磷酸化生成AMP。Rv2837c对多种类型的底物都具有降解活性,且不同底物的降解速率不同。目前,Rv2837c对不同底物的具体降解机制并不清楚。论文本部分主要通过结构生物学、分子生物学及微生物学等多种实验方法结合来解释Rv2837c的降解机制。主要研究内容和结论如下:(一)解析得到2.0 A的Rv2837c晶体结构,通过对结构进行分析比较以及突变体酶活测定确定了酶活反应需要两个锰离子参与。和其同源蛋白的多序列比对也表明两个锰参与降解反应的机制是普遍存在的。(二)解析得到2.3 A的Rv2837c降解c-di-AMP反应中间态的Rv2837c/pApA复合物的晶体结构。pApA作为c-di-AMP降解的中间产物,同时也属于一类nanoRNA,这一复合物晶体结构的取得为Rv2837c降解nanoRNA类核苷酸小分子提供了准确、真实的降解模型。根据复合物结构以及生化数据我们提出了简单的Rv2837c水解磷酸二酯键的酶活反应机制。(三)测定了 Rv2837c 降解不同环二核苷酸(c-di-AMP、c-di-GMP、3’-5’cGAMP)以及线性二核苷酸(pGpG、pApA)的降解速率,明确了 Rv2837c能特异识别并降解3’-5’磷酸二酯键。首次测定到Rv2837c能降解2’-5’ cGAMP生成线性二核苷酸 2’-5’-pGpA。(四)通过对c-di-AMP降解过程中底物及产物含量变化的实时检测,以及c-di-AMP 与 pApA 的酶活米氏曲线的测定,并结合动力学公式计算,推导得出了Rv2837c降解c-di-AMP时需要第一步反应的中间产物pApA在蛋白内部进行翻转,接着在酶活中心进行第二步水解反应产生2个AMP。(五)在敲除MSMEG-2630的耻垢分枝杆菌中以及MG1655中分别过表达Rv2837c蛋白,诱导表达后测定胞内c-di-AMP或c-di-GMP浓度以及MG1655移动性,实验结果表明Rv2837c在体内能降解c-di-AMP和c-di-GMP,且能通过c-di-GMP水平调控细菌的移动性。通过细菌体内实验以及对结核分枝杆菌基因组分析,我们推测Rv2837c在M tubeculosis中可能参与调控c-di-AMP、c-di-GMP两条信号通路。本论文第二部分主要对铜绿假单胞菌c-di-GMP调控的转录因子BrlR的晶体结构以及生理功能进行了研究。铜绿假单胞菌为革兰氏阴性菌,是医院内感染常见的条件致病菌,在烧伤菌血症感染、泌尿道感染、肺部感染及术后伤口感染中都是重要的感染来源,且这些感染是无法根除的。铜绿假单胞菌能引起诸多类型的感染主要依赖于它强大的毒力因子系统。而在临床抗感染治疗困难的主要原因在于铜绿假单胞菌能对多种抗生素产生耐药性。铜绿假单胞菌基因PA4878编码的蛋白BrlR,同源性分析表明属于MerR家族蛋白,仅在细菌生物被膜时表达且与生物被膜的耐药性相关基因的表达调控有关。随后的研究表明BrlR蛋白能结合并调控自身启动子以及mexA,mexE启动子激活外排泵的表达来增强细菌的耐药性,但是作为MerR家族蛋白却不受外排药物分子激活,而是受到c-di-GMP的结合调控,且与c-di-GMP结合比例为2:1。最初我们想通过结构解析来了解c-di-GMP与BrlR的结合机制,但随着研究的深入,我们发现BrlR是一个复杂的转录调控因子,受多种信号通路的调控。主要研究内容和结论如下:(一)解析得到3.1 A的BrlR晶体结构,通过结构比较发现BrlR蛋白三个独立的结构域在拓扑结构上与同源蛋白相比非常保守,但N端与C端的相对位置发生了改变。且同源蛋白一般为二聚体形式并以二聚体发挥功能,而BrlR相比同源蛋白形成了不同的自我封闭式的四聚体构型。(二)BrlR独特的四聚体构型导致其N端HTH结构域大部分被四聚体中另一亚基的C端结构域堵塞,这预示着BrlR蛋白结合DNA的能力应该很弱。随后通过FP实验以及EMSA实验验证了体外时BrlR对DNA的弱结合。(三)解析得到2.5 A的BrlR/c-di-GMP复合物晶体结构,发现BrlR的DNA结合结构域有两个c-di-GMP结合位点。通过相关突变体生化实验,确定BrlR蛋白确实存在两个c-di-GMP结合位点,且两个结合位点都有助于c-di-GMP促进BrlR-DNA的结合。(四)对结构进行分析比较发现BrlR的C端存在保守的药物结合口袋,尤其与同源蛋白SAV2435的拓扑结构非常相似,且BrlR蛋白以及BrlR的C端结构域(BrlR-C)都能结合EB分子,经过与SAV2435/RH6G复合物晶体结构比对以及相关突变体EB染色分析,确定了 BrlR-C具有结合多种药物分子的能力。利用SPR筛选结合的药物分子,最终确定BrlR能特异性结合妥布霉素和庆大霉素等氨基糖苷类抗生素。(五)由BrlR结合的药物分子构型,以及它可以结合EB等颜色小分子,推测其可能结合铜绿自身分泌的染料分子绿脓菌素(PYO)。通过SPR实验进行验证发现BrlR结合PYO的能力比结合妥布霉素及庆大霉素都高。经过多种晶体条件筛选,最终解析了 1.4 A的BrlR-C与PYO类似物的复合物结构。通过结构解析发现吩嗪环分子并不在经典的结合口袋而是位于紧邻其上方新的结合位置。这一新的结合位置更有利于PYO促进BrlR与DNA的结合,最终通过EMSA以及RT-PCR实验确定了 BrlR蛋白也是受绿脓菌素调控的转录调节因子。首次表明铜绿假单胞菌的抗药性与自身毒力因子之间有联系。