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为了调查奶牛布鲁氏菌病的流行和发病情况,本研究利用虎红平板凝集试验(RBT)和试管凝集试验(SAT)对浙江省奶牛养殖较为集中的金华地区30个奶牛场28243头奶牛进行布鲁氏菌病原普查,结果阳性牛1880头,阳性率为6.66%。采集布鲁氏菌阳性的奶牛奶样570份,通过使用选择性培养基将奶样中的细菌进行分离培养,分离纯化细菌62株。将纯化出的细菌进行革兰氏染色、柯兹罗夫斯基鉴别染色和生化试验,50株分离菌株符合布鲁氏菌生化指标特征。为了建立从奶品中监控布鲁氏菌感染的方法,本研究根据GenBank公布的牛布鲁氏菌基因序列设计内、外向引物,优化牛奶样品中布鲁氏菌基因组DNA提取方法,建立了牛奶布鲁氏菌套式PCR方法。结果显示,使用人工合成的两对布鲁氏菌16S rRNA套式引物,通过两次扩增,可有效扩增出牛奶中污染布鲁氏菌的16S rRNA的特异性DNA片段,其对牛奶样品中布鲁氏菌检测下限达3.3 CFU/ml,与细菌分离鉴定方法的吻合率为100%,与大肠杆菌、溶血性链球菌、沙门氏菌、克雷伯氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和螺旋杆菌之间不存在交叉反应。这些结果显示,本试验建立的布鲁氏菌套式PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性,适用于布鲁氏菌的实验室快速检测。对奶牛布鲁氏菌的分子分型进行探索。根据编码布鲁氏菌36kDa外膜蛋白的omp2基因多态性设计引物,利用PCR扩增和DNA测序,测序结果在NCBI上软件BLAST序列比对分析,51株菌中43株为B.abortus,8株为B. millitensis;利用布鲁氏菌omp2多态性只能分出布鲁氏菌的种,而不能区分具体种的生物型。转座因子IS711在不同种布鲁氏菌中存在插入位置的多态性,具有种属特异性,设计IS711通用特异性引物和B.abortus、B.melitensis、B.ovis、B.suis四个特异下游配对引物,以及可以扩增B.abortus5、6、9和3b型的引物DEL569构成AMOS-PCR,对51株布鲁氏菌进行检测,结果鉴定B.abortus5、6、9或3b型35株,B.abortus1、2或4型2株,B.melitensis5株,另有9株不能鉴定生物型。B. melitensis 16M rpoB基因编码,全长4134 bp,在各个种和生物型中均具有的多态性,通过对上述未分型9株细菌rpoB基因的克隆和序列分析,鉴定3株B. melitensis 1型,1株B. abortus 1或4型,1株B. abortus 7型,其余4株有待进一步鉴定。