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目的:Ⅱ相药物代谢酶主要包括葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronososyltransferases,UGTs）和磺酸转移酶（Sulfotransferases,SULTs）,其介导了人体很重要的Ⅱ相代谢和减毒过程,调控着药效和毒性。外排转运蛋白主要包括P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein,BCRP）和多药耐药蛋白（multidrug resistance-associated proteins,MRPs）等,它们主要介导药物、外源性物质和内源性物质在细胞的外排过程。Ⅱ相代谢酶与外排转运蛋白偶联调控药物的消除,如外排发生改变,原型的代谢过程亦会受到影响。本实验室前期研究表明山奈酚在体内主要经历葡萄糖醛酸化代谢,生成山奈酚-3-葡萄糖醛酸苷（kaempferol-3-glucuronide,K-3-G）和山奈酚-7-葡萄糖醛酸苷（kaempferol-7-glucuronide,K-7-G）,其中K-3-G是山奈酚最主要的暴露形式。此代谢路径主要由UGT1A9介导。BCRP、MRP1和MRP2负责K-3-G和K-7-G的外排。许多研究亦证明外排转运蛋白调控细胞内的葡萄糖醛酸化代谢,但是外排蛋白是否和如何调控亚细胞器中的葡萄糖醛酸化代谢尚不清楚。本实验选用自发荧光的山奈酚为模型化合物,动态地研究了外排转运蛋白对亚细胞器中的葡萄糖醛酸化代谢的调控作用及机制。方法:1.采用人源化UGT1A9、人肠微粒体（HIMs）和人肝微粒体（HLMs）考察山奈酚的葡萄糖醛酸化代谢特征。2.建立和验证同时检测细胞样品中山奈酚及其Ⅱ相代谢产物的液相色谱质谱（UHPLC-MS/MS）方法,并定量分析UGT1A9与外排转运蛋白对亚细胞器中山奈酚及其Ⅱ相代谢产物的影响。3.采用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察UGT1A9与外排转运蛋白对亚细胞器中山奈酚累积的影响。4.采用LSCM观察外排转运蛋白敲除对山奈酚在小鼠肝脏和小肠亚细胞器中累积的影响。5.考察UGT1A9和外排转运蛋白是否会影响山奈酚的药理作用,如活性氧自由基（ROS）的清除效率和核因子-E2相关因子2（Nrf2）的核转录。结果:1.山奈酚的葡萄糖醛酸化特性UGT1A9纯酶、人肠微粒体（HIMs）和人肝微粒体（HLMs）介导的山奈酚的3-OH和7-OH的葡萄糖醛酸化代谢反应均符合经典米氏方程。K-3-G在UGT1A9中的清除率值分别是HIMs的3.93倍,HLMs的10.75倍。K-7-G在UGT1A9中的清除率值分别是HIMs的3.35倍,HLMs的1.64倍。2.UGT1A9和外排转运蛋白抑制剂增加了亚细胞器中山奈酚的浓度和降低了葡萄糖醛酸代谢产物的浓度山奈酚被Caco-2/TC7细胞快速吸收,并在胞浆、细胞核、线粒体、内质网和溶酶体内被UGT酶代谢。山奈酚在各亚细胞器的浓度在30分钟达到最大值,并且山奈酚在线粒体（1.50 nmol/mg）的浓度是细胞核和溶酶体（0.57 nmol/mg）的3倍,是内质网（0.76 nmol/mg）的2倍。UGT1A9的抑制剂香芹酚（carvacrol）明显增加了山奈酚在各亚细胞器的浓度（P<0.05）,减少了 K-3-G与K-7-G的浓度。同样,BCRP的抑制剂Ko143、P-gp的抑制剂维拉帕米（verapamil）和Mrps的抑制剂MK571单独或联合加入后,明显增加了所有亚细胞器中山奈酚的浓度,减少了 UGT代谢产物的浓度,当这三种抑制剂联合使用时,山奈酚的浓度达到最大值。3.UGT1A9和外排转运蛋白抑制剂显著增加了山奈酚在亚细胞器的荧光密度山奈酚能与细胞核、线粒体、内质网和溶酶体共定位,说明山奈酚进入细胞后,迅速的分布在这些亚细胞器。山奈酚在各亚细胞器中的荧光密度在30分钟达到最大值。30分钟后,绿色荧光逐渐减少,表明山奈酚被UGT酶代谢并导致绿色荧光消失。香芹酚、Ko143、维拉帕米和MK571单独或联合加入后,显著增加了山奈酚在各亚细胞器中的荧光密度,减慢了荧光消除的速度。当Ko143、维拉帕米和MK571这3个外排转运蛋白抑制剂联合使用时,山奈酚在各亚细胞器中的荧光达到最大值。我们亦对UHPLC-MS/MS和LSCM两种方法测定的山奈酚含量进行相关性分析,结果显示山奈酚在各亚细胞器中的绝对含量和荧光密度具有高度相关性,相关系数大于0.76。4.外排转运蛋白缺失显著增加山奈酚在小鼠肝脏和小肠亚细胞器中的累积山奈酚口服后主要分布在小肠,其次是肝脏。增加的绿色荧光主要与线粒体共定位。山奈酚在Mdr1a-/-、Bcrp-/-和Mrp2-/-基因敲除小鼠的肝脏和小肠的荧光密度分别是野生型小鼠的1.56、2.10和2.77倍。5.山奈酚呈浓度依赖性抑制ROS的生成和诱导Nrf2的核转录山奈酚呈浓度依赖性地减少了细胞内ROS的荧光。并且,山奈酚的ROS清除效率与N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）相当。UGT1A9和外排转运蛋白的抑制剂增加了山奈酚在亚细胞器的含量,显著（P<0.001）降低细胞内的ROS水平。化学抑制剂对照组对ROS产生无显著影响。山奈酚呈浓度依赖性地增加了胞浆和细胞核中Nrf2的荧光。UGT1A9和外排转运蛋白的抑制剂增加了山奈酚在亚细胞器的含量,显著（P<0.001）增加了Nrf2的表达和核转录。化学抑制剂对照组对Nrf2的表达和核转录无显著影响。结论:1.我们首次通过采用化学抑制和基因敲除两种方法验证外排转运蛋白（P-gp、BCRP和MRPs）调控了亚细胞器中的葡糖醛酸化代谢。2.UGT1A9和外排转运蛋白调控山奈酚的亚细胞分布和相应的药理作用。3.本研究首次发现山奈酚主要累积在线粒体。作为优越的抗氧化剂,山奈酚可能对氧化应激相关的炎症疾病和衰老具有很好的疗效。