罗非鱼具有良好的生物学习性,能存活于恶劣的水质环境中,是一种重要的淡水养殖鱼类,也是我国南方地区重点推广的优良养殖品种之一。随着养殖规模的扩大,包括链球菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌等病原感染罗非鱼所引起的疾病已经严重制约罗非鱼养殖业的健康稳定发展。其中,由链球菌属成员中的海豚链球菌和无乳链球菌感染罗非鱼引起的链球菌病,每年都给全球罗非鱼养殖业造成惨重的经济损失。2009年夏季,海南省养殖罗非鱼大规模暴发了链球菌病,该病发病快,传染性强,发病率和死亡率高,造成的经济损失极其惨重。本研究以收集自海南多个养殖场的发病罗非鱼为研究对象,首先应用微生物学技术、组织病理学技术和间接原位PCR技术对发病罗非鱼的病原学和病理学进行研究,接着应用分子生物学手段研究了致病菌功能基因的分子特性、原核表达,旨在通过以上研究为该病的病原种属鉴定、生物学特性分析、快速诊断方法建立、发病机制提供科学参考,并为以该功能基因重组蛋白为主要抗原成分的新型渔用疫苗的研发奠定理论基础。1.罗非鱼无乳链球菌的分离和鉴定通过对7批次收集自海南省池塘养殖发病罗非鱼样品进行病原的分离、纯化和鉴定检测,从7批次的发病罗非鱼样品中分离到7株代表菌株,这些菌株在营养琼脂平板上的菌落形态极为相似,呈Y-溶血性,镜检形态为革兰氏阳性球菌。动物回归试验结果表明,分离菌株人工感染健康罗非鱼可复制出与自然发病罗非鱼极为相似的症状。7株代表菌株的16SrDNA基因序列与链球菌属成员菌进化关系最近,相似度均超过95.0%；菌株表面群抗原均与B组链球菌特征性群抗原吻合；菌株的API20Strep特征性生化鉴定结果读写值均为3663414,与无乳链球菌匹配度最高。综合上述结果,7株代表菌株均被鉴定为无乳链球菌。采用纸片琼脂扩散法分别对7株代表菌株进行药物敏感性试验,结果显示所有菌株对第二代头孢类药物美福仙均具有良好敏感性,而对其它药物则呈现不同程度的敏感性,例如有的菌株对临床上常用于防治链球菌病的青霉素、庆大霉素等药物完全耐药,有的菌株则表现敏感。7株代表菌株的基因组经二步扩增获得两条特异性条带,条带大小分别为688bp和272bp,均与参考标准中无乳链球菌Ia血清型菌株扩增条带特征一致,因此鉴定7株代表菌株属于Ia血清型。通过比较腹腔注射不含有／含有胞外产物的无乳链球菌菌液对罗非鱼的半数致死剂量差异,发现不含有胞外产物的菌液对罗非鱼的半数致死剂量(LD50)为2.4×107cfu/mL,含有胞外产物的菌液对罗非鱼的半数致死剂量(LD50)为6.9×106cfu/mL无乳链球菌胞外产物总蛋白含量和酶活性检测结果显示,胞外产物总蛋白浓度为1.6g/L具有降解脂酶和脲酶的活性,不具有降解蛋白酶、淀粉酶和卵磷脂酶的活性。3.无乳链球菌三重PCR快诊方法的建立与应用以无乳链球菌分离株cpsE、sip和cpsL基因为靶检测基因模板,分别设计三组特异性引物,应用于无乳链球菌三重PCR检测方法的构建。结果表明,建立的三重PCR检测方法具有良好的特异性,可以对无乳链球菌与包括海豚链球菌在内的七种病原菌进行区别鉴定；对无乳链球菌DNA样本的最低检测浓度为0.32ng/μl,最适Mg2+浓度为37.5mM,整个检测过程耗时100mmin左右。应用本三重PCR检测方法对人工感染罗非鱼样本和临床上收集的疑似无乳链球菌感染鱼样本进行诊断,结果显示,40尾人工感染罗非鱼的肝脏、肾脏组织DNA样本阳性检出率均为100%,22尾疑似无乳链球菌感染鱼的肝脏、肾脏组织DNA样本阳性检出率均为72.7%,对这两批样本的检测结果与常规细菌鉴定方法获得的结果完全一致。4.无乳链球菌对罗非鱼的病理损伤对自然发病和人工感染无乳链球菌的罗非鱼进行临床症状、组织病理学和超微病理学研究。结果显示,人工感染罗非鱼的临床症状与自然发病罗非鱼基本相同,均表现为下颌、鳃盖内侧及鳃盖边缘出现点状出血,鳍条基部有不同程度的充血；肝脏肿大充血颜色不均,质地脆弱,胆囊肿大；肠腔内有黄色透明黏液；肛门红肿；脑膜充血；所不同的是,自然发病罗非鱼眼球外突,而人工感染罗非鱼则无此症状。组织病理学上,发病罗非鱼均表现为全身性多组织器官的急性炎症反应和坏死；肝脏、脾脏和肾脏变性、坏死；脑水肿、心肌+心外膜炎和卡他性胃肠炎。超微病理学上,发病罗非鱼肝脏、脾脏和肾脏细胞超微结构破坏,细胞内可观察到细菌繁殖,脑组织基质血管内有大量病原菌分布。5.无乳链球菌在人工感染罗非鱼组织的分布与定位通过腹腔注射无乳链球菌分离株活菌液、无乳链球菌标准菌株活菌液和生理盐水的方式,制备罗非鱼人工感染阳性对照样品、待检样品和阴性对照样品。以无乳链球菌cpsE基因为模板设计特异性引物和寡核苷酸探针,应用于在已制备的阳性对照样品和阴性对照样品上进行的间接原位PCR方法的构建,并以建立的间接原位PCR方法检测待检样品,研究无乳链球菌分离株在罗非鱼体内组织的分布规律。结果表明,攻毒后2h,在罗非鱼脾脏红髓区首先检测到无乳链球菌阳性信号；攻毒后4h,在罗非鱼肝脏血窦和肝细胞内检测到无乳链球菌阳性信号；攻毒后12h,在罗非鱼肾脏、心肌和眼球也检测到阳性信号；攻毒后24h,在罗非鱼脑组织检测到无乳链球菌阳性信号；攻毒后36h,在罗非鱼的脾脏、肝脏、肾脏、心肌、眼球和脑组织可检测到大量的阳性信号。6.无乳链球菌cpsE基因的克隆、鉴定及分子特性分析对无乳链球菌分离株cpsE基因进行克隆和鉴定,并利用生物信息学软件对cpsE扩增序列进行分子特性分析。结果显示,无乳链球菌分离株cpsE基因推导氨基酸序列具有高度保守性,与人源、动物源无乳链球菌亲缘性达100%；序列中Lys和Val含量最高,分别为10.7%和10.1%；具有1个参与催化糖基元的糖基转移酶超级家族结构域,具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点3个,编码多肽链中亲水区大于疏水区,含有跨膜区,不存在信号肽；二级结构中,α-螺旋占的比例达40.94%,p-折叠占25.50%,p-转角占5.37%,无规则卷曲占28.19%。7.无乳链球菌cpsE基因的原核表达构建重组表达质粒pET-32a(+)-cpsE,并转入大大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,再利用SDS-PAGE、Western-blot和琼脂扩散试验对重组蛋白免疫原性进行研究。结果显示,当诱导剂IPTG的浓度为0.4mM时,转化菌株在30℃、34℃、37℃温度下诱导表达3h,在菌体经超声波破碎处理的沉淀成分中可检测到一种大小约36kDa的蛋白,与cpsE基因表达产物的预期大小相吻合。经Western-blot和琼脂扩散试验检测结果表示,CpsE重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔抗CpsE重组蛋白多克隆抗体的免疫效价达1：32。