背景:学习记忆的巩固过程是将获取的短时记忆转变为长时记忆的渐变过程。近年来的研究发现,基因和蛋白信号通路的激活表达等过程都参与了记忆的巩固过程。记忆获得后的基因转录表达和蛋白合成对记忆的巩固过程起到十分重要的作用。许多研究证实,表观遗传学修饰能够通过调控细胞内基因表达的变化,参与学习后记忆的巩固过程,并与许多神经系统疾病的发生密切相关。在其中,非编码小RNA(microRNA,miRNA)作为表观遗传的一种重要调控方式,已经证明其参与包括空间记忆,恐惧记忆在内的学习记忆消退及巩固过程,并与神经退行性疾病如阿尔兹海默病,帕金森病等息息相关。miRNA是一种内生的非编码小RNA,其细胞内的主要功能是作为一种转录抑制因子,通过与靶基因mRNA的3’UTR对应的区域结合,抑制靶基因mRNA的翻译,从而降低靶基因的蛋白水平。研究证实,许多miRNA能够调控突触及其形态的可塑性,并进一步参与不同阶段的学习记忆过程。然而,目前已经发现的miRNA有成千上万种之多,这么多的miRNA是否都在学习记忆过程中发挥作用?不同的miRNA在学习记忆中发挥相同还是不同的作用?哪些miRNA参与海马脑区的学习记忆过程?这一问题目前尚不清楚。目的:探究在CFC(contextual fear conditioning,场景性恐惧记忆)记忆巩固过程中发生内在表达变化miRNA;通过特异性阻断或过表达这些miRNA,在动物整体水平探究缺失或过表达特异的miRNA后对学习记忆巩固过程的影响,明确这些miRNA在学习记忆过程中的功能,并探究其分子调控机制,确定其参与学习记忆巩固过程所调控的靶基因或信号通路,为今后以特异性miRNA为靶点改善神经退行性疾病所造成的记忆缺陷提供理论依据。方法:1.探究在CFC训练后海马脑区发生表达变化的miRNA1.1通过基因芯片分析CFC训练后海马脑区发生变化的miRNA取8周大小的C57/BL6雄性小鼠,进行CFC训练,在CFC训练后1小时取海马脑区,以单独给予足底电击刺激后1小时的海马脑区为其对照,在杭州联川生物有限公司进行基因芯片分析,对芯片结果中信号强度大于500的miRNA进行分析,找到在CFC训练后发生显著变化的miRNA。1.2 RT-PCR验证上述被筛选出来的miRNA在CFC训练后1小时的变化我们将上述基因芯片筛选出来的所有miRNA进行RT-PCR的验证,发现在CFC 训练1小时之后 miR-181a,miR-126,miR-222,miR-143,miR-151a 等 miRNA水平上调,而miR-125, miR-690二者的水平下调。1.3海马脑区特异性阻断上述miRNA后检测其对小鼠CFC学习记忆的影响我们采用不同的antagomirs来特异性阻断相应的miRNA。我们在给小鼠海马脑区分别注射miR-143和miR-181a的antagomirs之后,进行CFC训练及测试,结果发现海马脑区miR-143被阻断后对场景性恐惧记忆的获得和巩固过程均无影响;而阻断miR-181a后小鼠场景性恐惧记忆的获得并未受到影响,而巩固过程则受到明显损伤,这个实验说明miR-181a参与小鼠CFC的巩固过程,而miR-143则可能不参与。接下来,为了验证其他有变化的miRNA在海马依赖性学习记忆中的功能,我们会继续将不同miRNA的antagomirs注射进小鼠海马脑区,进行CFC训练和测试,观察其是否对小鼠的学习记忆功能产生影响。1.4海马脑区特异性过表达上述miRNA后对CFC学习记忆的影响我们将采用慢病毒注射的方式在海马脑区来特异性过表达不同的miRNA,在注射过表达慢病毒四周后进行CFC训练和测试,观察过表达miR-181a或其他miRNA能否对小鼠场景性恐惧记忆产生影响。2.探究miR-181a及其他miRNA参与CFC记忆巩固过程的调控机制2.1 Luciferase reporter assay 验证 miR-181a 对 PRKAA1 和 REDD1 的调控通过前期实验发现,miR-181a参与海马脑区CFC记忆的巩固过程。miRNA在细胞中通常是作为一种转录抑制因子而存在,那么miR-181a究竟是通过调控何种靶基因来参与海马脑区CFC记忆的巩固过程的呢?我们首先通过不同的软件(Targetscan, miR-22,miRDB,microcosm)预测在细胞中可能受到 miR-181a调控的靶基因,然后将每个软件预测出的结果通过KEGG分析这些受miR-181a调控的靶基因所在的信号通路,最后将这四个软件的KEGG分析结果取交集,缩小筛选范围。通过这种方法,我们发现mTOR信号通路中的PRKAA1和REDD1这两个蛋白可能是受到miR-181a调控的靶基因。为了验证我们的预测是否准确,我们将这几个基因与miR-181a结合的3’UTR区域连接到特殊的质粒上,并将其种子序列进行了突变处理作为对照,然后分组进行Luciferase reporter assay实验,验证PRKAA1和REDD1在细胞中是否受到miR-181a的直接调控。2.2 CFC训练后miR-181a对PRKAA1和REDD1蛋白变化的调控上述实验如果能够确定在细胞中miR-181a可以直接调控PRKAA1和REDD1的表达,那么接下来我们想要知道在CFC记忆过程中,miR-181a是否也能通过调控这两个靶基因来参与呢?为了解决这一问题,我们首先想要观察一下在CFC训练之后不同时间点PRKAA1和REDD1是否发生变化?其变化趋势和miR-181a在CFC训练后的变化能否相对应?我们拟在CFC训练之后0小时,1小时,2小时,4小时,8小时分别取材,检测这两个蛋白的表达水平。接下来,我们想通过在小鼠海马脑区注射antagomirs来特异性阻断海马脑区的miR-181a,然后再给予小鼠CFC训练刺激,最后取出小鼠海马脑区检测在阻断miR-181a后,CFC训练刺激能否依然降低PRKAA1和REDD1的蛋白水平。通过上述实验,我们将判断在CFC记忆过程中,miR-181a能否调控PRKAA1和REDD1这两个靶蛋白。2.3 miR-181a参与CFC记忆的巩固过程依赖其靶基因PRKAA1和REDD1为了更深入的研究miR-181a能否调控靶基因PRKAA1和REDD1参与海马CFC记忆的巩固过程,我们将在行为学层次探究miR-181a参与海马CFC记忆的巩固是否依赖于PRKAA1和REDD1这两个靶基因。为了解决这一问题,我们拟进行下面的实验研究:2.3.1 PRKAA1和REDD1在海马CFC学习记忆中的功能研究为了探究PRKAA1和REDD1在海马CFC学习记忆中的功能,我们拟采用分别在小鼠海马脑区注射PRKAA1的抑制剂C9和激动剂AICAR来特异性抑制或激活PRKAA1,然后进行CFC训练刺激,观察阻断或激活PRKAA1对海马CFC学习记忆过程的影响。同时,我们制作了 REDD1蛋白的干扰和过表达慢病毒,并在小鼠海马脑区通过免疫荧光染色和western blot检测病毒表达范围及REDD1蛋白的干扰和过表达效率。接下来,我们拟将我们制作的慢病毒注射进小鼠海马脑区,然后进行小鼠CFC训练和测试,观察阻断或过表达小鼠海马脑区REDD1之后对CFC学习记忆的影响。2.3.2 miR-181a调控PRKAA1和REDD1参与CFC记忆巩固过程的研究为了探究miR-181a参与海马CFC记忆的巩固过程是否依赖靶基因PRKAA1和REDD1,我们拟进行下述实验:我们将小鼠分为四组,一组为对照组;第二组在小鼠海马脑区注射miR-181a过表达病毒,为miR-181a过表达组;第三组在小鼠海马脑区注射PRKAA1的激动剂AICAR和REDD1的过表达慢病毒,为过表达靶蛋白组;第四组在小鼠海马脑区同时注射miR-181a过表达病毒和AICAR及REDD1过表达慢病毒,为纠正组。然后我们将这四组小鼠分别进行CFC检测,观察过表达下游靶蛋白能否阻断上游miR-181a过表达对CFC行为促进的影响。3.探究miR-181a对mTOR信号通路的调控3.1 CFC训练之后miR-181a对mTOR信号通络的调控研究根据文献报道,PRKAA1和REDD1这两个分子都属于mTOR信号通路,都是mTOR上游的抑制蛋白。既然海马脑区的miR-181a能够通过抑制PRKAA1和REDD1来参与CFC记忆的巩固过程,那么miR-181a最终能否调控mTOR信号通路来参与CFC记忆的巩固过程?我们首先拟在CFC之后不同时间点检测mTOR蛋白的活性变化。接下来我们首先要探究海马脑区miR-181a在CFC训练后能否调控mTOR蛋白的活性。我们在小鼠海马脑区注射miR-181a的antagomirs来阻断miR-181a,然后对这些小鼠进行CFC训练,训练结束后4小时取出小鼠海马脑区,检测mTOR蛋白活性的变化,观察阻断miR-181a之后能否阻断CFC训练引起的mTOR蛋白活性升高,以此来观察在CFC记忆巩固过程中miR-181a能否调控mTOR蛋白的活性变化。3.2 miR-181a参与海马CFC记忆的巩固过程依赖于mTOR活性变化的研究3.2.1在海马CFC记忆巩固过程中PRKAA1和REDD1与mTOR的调控关系目前研究已经证实,在细胞水平PRKAA1和REDD1都能够分别抑制mTOR的活性,然而,在行为学中,PRKAA1和REDD1能否调控mTOR蛋白来参与海马学习记忆过程尚不清楚。为解决这一问题,我们设计将小鼠随机分成4组,第一组为对照组;第二组给小鼠海马脑区同时注射PRKAA1的抑制剂C9和REDD1的干扰病毒,为靶基因阻断组;第三组在小鼠海马脑区注射mTOR蛋白的抑制剂雷帕霉素,为mTOR抑制组;第四组在小鼠海马脑区同时注射C9+REDD1干扰病毒+雷帕霉素,为纠正组。然后对这四组小鼠同时进行CFC训练和测试,通过同时抑制上游和下游分子来检测阻断mTOR蛋白后能否影响上游分子PRKAA1和REDD1对CFC巩固过程的影响,以此来观察在行为学中,PRKAA1和REDD1能否通过调控mTOR蛋白活性来参与CFC的巩固过程。3.2.2在CFC记忆巩固过程中miR-181a与mTOR的调控关系假设上述实验证实海马脑区的PRKAA1和REDD1能够调控mTOR蛋白活性来参与CFC记忆的巩固过程,既然miR-181a能够调控PRKAA1和REDD1来参与CFC记忆的巩固过程,那么miR-181a能否调控mTOR信号通路的活性变化来参与CFC记忆的巩固过程?我们拟通过下面实验来验证我们的假设。我们将小鼠随机分成四组,其中第一组为对照组;第二组为miR-181a过表达组;第三组为mTOR抑制组;第四组同时在小鼠海马脑区注射miR-181a过表达病毒+雷帕霉素,为纠正组。我们将对这四组小鼠同时进行CFC训练和测试,然后观察mTOR蛋白被抑制后能否损伤miR-181a过表达引起的CFC记忆增强,以此来观察在行为学中,miR-181a能否通过调控mTOR信号通路的活性变化来参与小鼠CFC记忆的巩固过程。结果:1. CFC训练之后1小时海马脑区miR-181a的表达升高我们在CFC训练后1小时和6小时取小鼠海马脑区,通过RT-PCR验证发现,在CFC训练后1小时,miR-181a表达显著升高,而单独给予环境暴露或足底电击刺激并不能提高miR-181a的表达水平。2. miR-181a参与调控小鼠CFC记忆的巩固过程我们将小鼠海马脑区miR-181a阻断后,进行CFC训练和测试后发现,阻断小鼠海马脑区miR-181a并不影响小鼠CFC训练和短时记忆,但损伤了小鼠CFC的长时记忆。相反,过表达miR-181a后,在低电流刺激下,小鼠CFC记忆的巩固过程显著增强。随后,我们发现,阻断小鼠海马脑区miR-181a并不影响小鼠的运动能力及焦虑样行为。3. miR-181a调控的靶基因筛选我们首先采用Targetscan, miR-22, miRDB,microcosm这四种预测软件预测miR-181a可能调控的靶基因。随后采用KEGG分析方法,将每一种软件预测出的众多靶基因都用KEGG分析其所在的信号通路。最后将四种软件的KEGG分析结果取交集。我们发现所有预测出的信号通路中都包含mTOR信号通路。在mTOR信号通路中,PRKAA1和REDD1这两个分子都被预测到可能受miR-181a的调控。我们通过luciferase reporter assay实验验证发现,PRKAA1和REDD1在细胞中受到miR-181a的调控,是miR-181a的靶基因。4. PRKAA1和REDD1在CFC训练之后的表达下调受到miR-181a的调控我们取naive以及CFC训练后0小时,1小时,2小时,4小时和8小时小鼠的海马脑区,检测其中PRKAA1、REDD1和mTOR活性的变化情况。实验结果表明,在CFC训练后4小时,PRKAA1和REDD1的蛋白水平显著下调,而mTOR活性水平显著升高。当阻断小鼠海马脑区的miR-181a后,小鼠海马脑区的PRKAA1和REDD1蛋白水平显著提升,而CFC训练刺激能够显著降低PRKAA1和REDD1的蛋白水平;当阻断miR-181a后再进行CFC训练刺激后小鼠海马脑区的PRKAA1和REDD1蛋白水平则不再下调,而mTOR活性也不再升高。这个实验说明,在CFC训练后,小鼠海马脑区的miR-181a能够调控mTOR信号通路的蛋白变化。我们在CFC训练之后不同时间点检测了 Hoxa11,Bc12,Msx2这三种已明确为miR-181 a的靶蛋白的变化情况,发现Hoxa1 1和Bcl2在CFC之后表达上调,而Msx2则并无明显变化。这三种靶基因在CFC训练之后的变化和miR-181a的变化情况并不一致,说明在CFC记忆过程中miR-181a并没有主要调控这三种靶基因来参与海马的学习记忆过程。5. miR-181a参与CFC记忆的巩固过程依赖靶基因PRKAA1和REDD1我们在低电流刺激下给予小鼠CFC训练和测试,发现单独阻断海马脑区的PRKAA1或REDD1导致小鼠CFC记忆的巩固过程明显增强。同时阻断PRKAA1和REDD1也能显著增强小鼠CFC记忆的巩固过程。相反的,单独过表达或同时过表达PRKAA1和REDD1能够明显损伤小鼠CFC记忆的巩固过程。我们通过正反两方面的实验验证了 PRKAA1和REDD1确实参与了小鼠CFC记忆的巩固过程。实验结果表明,当过表达miR-181a后,小鼠海马CFC记忆的巩固过程显著增强;当过表达PRKAA1和REDD1时,小鼠海马CFC记忆的巩固过程显著下调;而当同时过表达小鼠海马脑区miR-181a和靶基因PRKAA1和REDD1后,原本由于过表达miR-181a而促进的CFC记忆巩固过程则被完全阻断,这个实验结果说明miR-181a参与CFC的巩固过程依赖于靶基因PRKAA1和REDD1。6. miR-181a调控CFC巩固过程依赖于mTOR信号通路阻断小鼠海马脑区的PRKAA1和REDD1后,小鼠CFC的巩固过程显著增强,而阻断小鼠mTOR活性时能够明显损伤小鼠的CFC巩固过程。当我们同时阻断上游的PRKAA1和REDD1及下游分子mTOR的活性时,原本由于抑制PRKAA1和REDD1蛋白导致小鼠海马脑区CFC的巩固过程增强则被完全损伤。这个实验证实PRKAA1和REDD1能够通过调控mTOR蛋白活性参与CFC的巩固过程。当过表达miR-181a后,小鼠海马脑区CFC记忆的巩固过程显著增强;当抑制mTOR活性时,小鼠CFC记忆的巩固过程明显受到损伤。而当我们同时过表达miR-181a和抑制mTOR蛋白活性后,原本由过表达miR-181a增强的海马CFC记忆巩固过程被完全阻止。这个实验证实,小鼠海马脑区的miR-181a最终通过调控mTOR信号通路活性来参与CFC记忆的巩固过程。实验结论:1.通过本课题的研究,我们发现miR-181a参与了小鼠海马脑区的CFC记忆的巩固过程。2.通过软件预测和luciferase reporter assay实验验证发现miR-181a能够调控mTOR信号通路中的两个上游分子PRKAA1和REDD1。3.我们发现PRKAA1和REDD1能够参与小鼠海马脑区CFC记忆的巩固过程。4.我们确定了在小鼠海马脑区CFC训练过程中,上调的miR-181a能够抑制靶蛋白PRKAA1和REDD1的表达,继而激活mTOR蛋白,最终参与CFC记忆的巩固过程。5.我们的实验为进一步了解miRNA在学习记忆中的功能提供了理论基础,为日后以miRNA为基础治疗临床疾病提供了理论指导。