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研究背景和目的:
中间神经元(interneuron)指的是那些分布于兴奋性主细胞周围，轴突投射局限于其胞体所在脑区，对主细胞(principal cell)的兴奋性起调节作用的神经细胞。中间神经元特异性地表达一些分子标志物，常见的有以下几类：钙结合蛋白类包括小白蛋白(PV)、钙视网膜蛋白(CR)和钙结合蛋白(CB)，神经肽类如生长抑素(SOM)、神经肽Y(NPY)、胆囊收缩素(CCK)和血管活性肠肽(VIP)等，酶类以及受体类等。虽然不是全部但有些分子标志物的表达与部分中间神经元的分布、形态、放电类型、轴突投射以及功能有密切联系。
一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，nNOS)催化L-精氨酸氧化生成一氧化氮和L-瓜氨酸。nNOS有三种类型，分别为神经型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。研究发现nNOS在部分中间神经元有较强的表达，且不同脑区nNOS阳性中间神经元的分布密度不同，但到目前为止对表达nNOS中间神经元的分布、解剖特征、电生理学性质、轴突投射以及它们在神经网络中的作用所知甚少。本课题利用免疫组织化学研究了大鼠海马齿状回nNOS阳性中间神经元的分布特征、GABA能性以及与其它常见中间神经元分子标记物的共表达。
材料和方法:
实验动物为成年雄性SD大鼠(体重450±50 g，11-13周龄)。腹腔内注射戊巴比妥钠麻醉后，以4％多聚甲醛经心脏灌流进行组织固定，取脑。随后将脑浸泡在同样的固定液中过夜。在以阶梯增加的蔗糖磷酸缓冲液保护、明胶，卵白蛋白-戊二醛混合液包埋脑组织标本后，用振动切片机制作60微米厚的水平面海马脑片。每隔八张脑片取一张作为样本，以漂染法对脑片进行免疫荧光双标。所用一抗为抗nNOS、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)、SOM、NPY、VIP和PV等。以普通荧光纤维镜对标本进行观察、拍照后，对海马齿状回不同层分别进行阳性细胞计数和面积测定，以此计算单位面积中nNOS阳性神经元数(细胞数/mm2)。对部分切片以共聚焦进行扫描。
结果:
对两种不同来源的nNOS抗体进行荧光双染证明由这两种抗体所致免疫荧光完全重合。在海马齿状回分子层、颗粒细胞层和门区，nNOS阳性细胞的密度分别为23.1±1.9/mm2、24.1±10.7/mm2和143.1±13.8/mm2。nNOS/GAD67免疫荧光双标显示分子层和颗粒细胞层nNOS阳性细胞与GAD67有共表达的百分率分别为96.2±2.5%(n=6)，95.6±5.6%(n=6)，但在门区，nNOS阳性细胞表达GAD67的百分率仅为82.3±4.7%。上述结果提示nNOS在齿状回的表达具有层特异性。通过nNOS与PV、NPY、SOM和VIP的免疫荧光双标，我们发现在门区，nNOS阳性中间神经元与PV、NPY、SOM和VIP有共表达的百分率分别为8.6±2.6%、10.3±0.6%、13.8±3.0%和1.6±0.5%。
结论:
1.在大鼠海马齿状回中，nNOS阳性中间神经元在齿状回的分布具有显著的层特异性，以门区的分布密度最高。
2.在齿状回分子层和颗粒细胞层，几乎所有的nNOS阳性细胞均为GABA能性中间神经元，但在门区，仅4/5的nNOS阳性神经元为GABA能中间神经元。
3.nNOS阳性与其它常见的中间神经元分子标志物包括PV、SOM、NPY和VIP存在频度较低的共表达，其中共表达NPY的比例最高(14%)，共表达VIP最低(1.6%)。