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目的基于TCGA数据库的基因突变测序数据来预测肿瘤新生抗原,结合生物信息学设计抗原表位肽,通过免疫原性实验筛选出理想的抗原表位肽,诱导能高效激活细胞免疫反应的特异性CTL克隆,并对其TCR基因表达情况进行分析,分析将特定肿瘤新抗原作为抗肿瘤治疗靶点的可能性。方法一、在TCGA数据库中筛选出结直肠癌,肺癌,肝癌基因前10位碱基单取代的高频突变位点,运用生物信息学计算机预测算法选择与MHC亲和力高的3组抗原表位肽并合成。基于TCGA数据库,查找表达KRAS G12V,TP53 R158L,CTNNB1 K335I突变型及野生型癌症患者的生存资料,并对其生存曲线进行分析。探讨KRAS G12V,TP53 R158L,CTNNB1 K335I突变热点分布在各癌症中的发生率及覆盖率。二、通过流式初步检测3组抗原表位肽与MHC分子的亲和力,用各组突变肽与野生肽体外诱导出特异性细胞毒性T淋巴细胞。通过IFN-r的分泌和钙黄绿素的检测方法,初步验证肽诱导特异性CTL对负载肽-T2细胞模型的杀伤功能。三、构建表达3个点突变基因的重组真核表达质粒并分别转染入HCT116结肠癌细胞,NCI-H292肺癌细胞,Hep G2肝癌细胞系,通过流式细胞仪检测转染效率和q PCR检测点突变基因在肿瘤细胞系中的表达情况。用钙黄绿素法和CFSE-PI染色法验证肽诱导特异性CTL对野生型与突变型的肿瘤细胞的细胞毒作用。流式检测肽特异性CTL杀伤野生型与突变型肿瘤细胞颗粒霉素B的表达,以及ELISA检测IFN-γ和穿孔素的分泌情况。四、提取诱导前的原PBMC细胞,CTNNB1突变肽(IMRTYTYEI)诱导的特异性T细胞的RNA样本并反转录,采用多重PCR扩增及毛细管电泳检测CTNNB1突变肽(IMRTYTYEI)诱导的特异性T细胞TCR Vα和Vβ链CDR3区基因的表达情况。结果一、结合TCGA数据库找到KRAS G12V,TP53 R158L,CTNNB1 K335I的3组高频基因突变位点,通过肽预测算法筛选出3组野生肽与突变肽,包括KRAS G12V组野生肽与突变肽,TP53 R158L组野生肽与突变肽,CTNNB1 K335I组野生肽与突变肽。通过生存分析发现KRAS G12V点突变的结肠癌患者总体生存率(OS)高于KRAS非G12V突变的其他结肠癌患者;且预测的3组肿瘤新抗原在肿瘤患者中有一定的覆盖率,有较好的临床应用价值。二、经流式初步检测,CTNNB1组突变肽与HLA-A2分子的亲和力较好(P<0.001);经DC负载肽诱导培养的抗原特异性CTL细胞,是以CD8+T细胞毒性Tc细胞为主的T细胞。Elisa初步检测表明,CTNNB1组肽诱导的特异性CTL对负载肽-T2细胞的IFN-r分泌量最多(P<0.05),其次是TP53组和KRAS组;CTNNB1组突变肽特异性CTL对负载肽-T2细胞模型的杀伤率均高于其余2组。三、3组点突变基因在肿瘤细胞系中的转染效率较高且呈过表达状态。经钙黄绿素和CFSE-PI法的检测,发现3组突变肽诱导特异性CTL对肿瘤细胞杀伤率均高于野生肽诱导的CTL(P<0.001)。但与TP53组和KRAS组相比,CTNNB1组突变肽诱导特异性CTL对突变型和野生型肿瘤细胞的细胞毒作用更强(P<0.01)。通过流式检测颗粒酶素B,ELISA检测穿孔素和IFN-γ的分泌情况,发现CTNNB1突变肽组颗粒酶素B,穿孔素和IFN-γ的分泌浓度均远高于TP53组和KRAS组(P<0.01)。四、经毛细管电泳分析,发现CTNNB1突变肽(IMRTYTYEI)诱导后的CTL细胞部分TCR Vα链CDR3区的Vα14,Vα7,Vα9亚家族和TCR Vβ链出现Vβ1,Vβ15,Vβ18亚家族发生了克隆性增殖。结论本研究发现,3组筛选出来的点突变抗原表位肽均能提高特异性T细胞的细胞毒作用,其中CTNNB1突变肽(IMRTYTYEI)诱导作用最强,能高效激活T细胞免疫反应,介导针对肿瘤细胞的特异性细胞毒作用。本研究提示,CTNNB1 K335I点突变表位肽可能具有应用于个体化细胞免疫疗法的潜力。