论文部分内容阅读
核苷酸类物质是新近阐明的细胞间通讯载体,它们结合细胞膜上的P2家族嘌呤受体,调节细胞的生存和功能。根据结构P2家族受体可分为P2X和P2Y两个家族,其中P2X家族受体则属配体门控的离子通道,可以形成功能性通道,与配体结合后构象改变,实现通道开启、关闭和离子的通透。P2X7是该家族中最晚克隆的成员,它不仅表达在神经、肌肉等组织,在造血系统和免疫细胞中,如单核/巨噬细胞、B和T淋巴细胞都可检出它的表达。P2X7受体的表达与白血病密切相关,其表达和功能与慢性B淋巴细胞白血病（B-CLL）患者的预后有关;我们也发现,P2X7受体在白血病中广泛表达,阳性率和表达水平明显高于正常人,其高表达的患者缓解率低。此外,我们在白血病细胞系中发现了P2X7受体功能的异常,而高表达CD39相关的ATP酶活性是LCL-H细胞P2X7受体功能异常的原因。J6-1细胞还存在其它机制,遂从中克隆P2X7受体基因,得到了一个559位单点突变的全长序列和一个缺失73个bp的选择性剪接体。本文以它们为研究重点,深入探讨二者对于P2X7受体功能调控的影响:1.J6-1细胞来源的P2X7受体在第559位有一个A→G有义突变,导致Asn187→Asp187,用该突变体真核表达载体转染不表达P2X家族受体的Ramos细胞,获得稳定表达细胞株（Ramos—P）,并以稳定转染空载体的细胞为对照;RT-PCR、Western blot、激光共聚焦显微镜检测P2X7受体表达、定位及BzATP刺激下受体的聚集;MTT法测定细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期。结果证实稳定表达突变型P2X7受体和对照细胞株构建成功,突变型P2X7受体主要定位于细胞膜和细胞质;表达突变型P2X7受体的细胞增殖能力显著高于对照细胞;高浓度的激动剂（300μmol/L BzATP）增加细胞凋亡率;100μmol/L BzATP诱导P2X7受体聚集。2.从J6-1细胞中克隆了一个缺失73个bp的P2X7受体基因选择性剪接体,推测可能与J6-1细胞P2X7受体钙功能缺失相关,因此进行了如下工作:选用pIRES载体,构建五种真核表达载体:全长序列表达载体（PIRESA）,截短的选择性剪接体表达载体（PIRESB）,选择性剪接体表达载体（PIRESC）,全长序列和截短的选择性剪接体双表达载体（PIRESA+B）,全长序列和选择性剪接体双表达载体（PIRESA+C）。经测序显示成功构建上述重组质粒载体。3.将五种表达载体和PIPES空载体转染无P2X家族受体表达的Ramos细胞和K562细胞,获得了稳定表达细胞株,为进一步P2X7受体的功能调控研究奠定基础。本论文为深入研究P2X7受体在白血病中的作用及其功能调控提供了有益的实验基础。