食物蛋白源降血压肽——血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽因其具有作用持久、安全、无毒副作用等优点,可做为功能食品替代部分药物起到降血压辅助治疗作用。将磁性分离技术与传统分离方法相结合,可实现ACE抑制肽的快速分离纯化。本文以琼脂糖和Fe304为原料,采用反相微乳包埋法制备磁性琼脂糖微球,将其做为载体,制备磁性亲和介质,用于长蛇鲻酶解液中ACE抑制肽的分离,经反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步纯化后,得到一个新的ACE抑制肽,并对其作用机理进行了初步研究。取得的主要研究结果如下：(1)采用反相微乳包埋法制备磁性琼脂糖微球(MAMs)。以琼脂糖和自制Fe304磁流体为原料,采用反相微乳包埋法制备磁性琼脂糖微球,以微球平均粒径做为考察指标,用单因素实验优化磁性微球的制备工艺条件。用扫描电子显微镜(SEM)、傅立叶红外光谱仪(FTIR)、热重分析仪(TG)以及振动磁强计(VSM)对微球的性能进行表征。实验结果表明,当琼脂糖浓度为25.0g·L-1,水油比W/O为1:10, Span 80浓度为40.0 g·L-1,乳化温度为80℃,搅拌速度为900r·min-1, Fe3O4浓度为4.5 g·L-1时,制备的磁性琼脂糖微球平均粒径为10.69 μm,具有良好是分散性,Fe304含量为29.5%,磁饱和强度为5.67 emu·g-1,微球具有超顺磁性,在外加磁场的作用下可快速实现固液分离。(2)以环氧氯丙烷为活化剂对微球进行活化。以环氧基密度为考察指标,采用单因素实验优化活化工艺条件。结果表明,在NaOH溶液浓度为0.9mol·L01,环氧氯丙烷体积分数为40.0%, NaBH4的浓度为0.5 g·L-1,活化温度为40℃,活化时间为4h时,磁性琼脂糖微球表面的环氧基密度最高,达到123.96μmol·g-1。(3)以磁性琼脂糖微球作为载体,亚氨基二乙酸(IDA)为连接臂,将Zn2+固定到已活化的磁性琼脂糖微球上,制备磁性固定化金属亲和介质MAMs-IDA-Zn2+。以Zn2+螯合量为考察指标,通过单因素实验优化制备工艺条件,在IDA接合时间为8h、IDA浓度为0.8mol·L-1、Zn2+螯合时间为60 min, Zn+浓度为0.03 mol·L-1的条件下,Zn2+螯合量达到最大值101.69μmol·g-1。(4)采用磁性固定化金属亲和层析法对猪肺ACE进行分离纯化。以蛋白吸附量为考察指标,采用单因素实验优化吸附条件。在蛋白浓度为3.0mg·mL-1, NaCl浓度为0.5 mol·L-1,吸附时间为20 min, pH值8.3的条件下,ACE全部吸附到MAMs-IDA-Zn2+上,吸附的蛋白ACE比活为0.037 U·mg-1。在NH4Cl浓度为1.0 mol·L-1, pH值7.8,洗脱时间为40 min的条件下,可将吸附的ACE洗脱下来,得到的ACE比活为0.160 U·mg-1,纯化倍数为14.3,酶活回收率为65.8%。(5)采用共价结合法将猪肺粗提ACE固定到活化的磁性琼脂糖微球上,制备磁性固定化ACE(MAMs-ACE)。以MAMs-ACE的比活为考察指标,采用单因素实验对制备工艺条件进行优化。结果表明,在蛋白浓度为8.0mg·mL-1、时间为2 h、温度为50℃、pH值7.8的条件下,得到的MAMs-ACE活力最高,达到0.128 U·g-1。同时,还对MAMs-ACE的性质进行了研究,MAMs-ACE的最适pH值为7.8,最适温度为42℃,比游离ACE具有更好的pH稳定性和热稳定性；重复使用10次后, MAMs-ACE活力仍保持53.0%,具有良好的操作稳定性；MAMs-ACE在-20℃条件下保存30天后,仍保持90.3%的酶活,而游离酶只保留了43.0%,说明MAMs-ACE具有更好的储存稳定性。对ACE的米氏常数Km进行测定,发现MAMs-ACE的Km相对游离ACE变小,说明ACE的固定化有利于酶与底物的结合。(6)对MAMs-ACE的吸附性能进行研究。以ACE抑制肽HLPLP为特异性吸附模版蛋白,研究MAMs-ACE的特异性吸附性能。结果表明,在HLPLP浓度为4.0 mg·mL-1,吸附时间为30min, NaCl浓度为0.3 mol·L-1,pH值为7.8的条件下,特异性吸附量达到最大值22.77 mg·g-1。以牛血清白蛋白(BSA)为非特异性吸附的模版蛋白,在相同实验条件下确定MAMs-ACE的最大非特异性吸附量为2.46 mg·g-1,是特异性吸附量的10.8%,说明MAMs-ACE具有良好的特异性吸附,可用于ACE抑制肽的分离纯化。(7)将MAMs-ACE做为磁性亲和介质,用于长蛇鲻酶解液中ACE抑制肽的分离纯化。以蛋白吸附量为考察指标,通过单因素实验优化吸附工艺条件,在蛋白浓度为8.0 mg·mL-1,吸附时间为45 min, NaCl浓度为0.2mol·L-1, pH值为7.8的条件下,MAMs-ACE对蛋白的吸附量达到最大值29.50 mg·g-1。用2.0 mol·L-1 NaCl溶液反复洗脱8次,每次30 mmin,可将90.0%的蛋白洗脱下来。MAMs-ACE的吸附量随重复使用次数的增加而降低,最多只能重复使用4次。用RP-HPLC对亲和纯化的多肽进一步分离,得到单一的活性组分,质谱仪解析得到该组分的氨基酸序列为：Gly-Met-Lys-Cys-Ala-Phe (GMKCAF), IC50为45.7 μmol·L-1。(8)采用Lineweaver-Burk双倒数做图法对GMKCAF (GF-6)的抑制类型进行研究,确定GF-6属于非竞争性抑制剂。分别用初始速率法和等温滴定量热法(ITC)对测定ACE米氏常数Km,对结果进行比较。初始速率法和ITC法测得的Km分别为0.327 mmol·L-1和0.347 mmol·L-1,说明ITC测定的结果是可信的。(9)采用ITC对captopril和GF-6的抑制热力学进行研究。通过ITC实验得到了captopril和GF-6与ACE结合反应的热力学参数：结合常数Ka、化学计量数n、ΔH、ΔCp和AG。结果表明,captopril和GF-6与ACE的结合反应都是自发进行的吸热过程,captopril以1：1的比例与ACE结合,抑制肽GF-6以40：1的比例与ACE进行结合,进一步验证了它们的抑制类型。同时,对captopril和GF-6对ACE结合过程进行热力学研究。结果表明,captopril和GF-6与ACE的结合存在着很好的焓-熵补偿关系,都属于熵驱动过程。