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糖尿病(Diabetes,DM)是一种严重的威胁全球公共健康的疾病,中国的情况尤为严峻,中国已成为世界上患DM人数最多的国家之一,约占全球病患的1/3。临床上,DM的主要标志是高血糖、高血脂、高黏血症。DM主要分为两种类型,1型糖尿病(Type 1 diabetes,T1DM)和2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2DM)。T2DM为非胰岛素依赖型DM,其发病机制主要包括胰岛素分泌缺陷或胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)。DM可以导致多种并发症,其中最严重的是糖尿病血管性疾病。由于血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)在糖尿病血管病变的进程中发挥重要作用,因此,通过调控VSMC来逆转糖尿病血管病变有广泛的应用前景。VSMC有收缩/合成型两种表型。收缩型细胞形态为长梭状,含有许多可以收缩的纤维丝。合成型细胞呈鹅卵石状,形态和上皮细胞、菱形状细胞类似,细胞内含有大量合成蛋白质所需的细胞器。正常生理情况下,VSMC的主要作用是收缩血管及维持血管的弹性,表现为收缩型,增殖迁移活性较低。但当IR出现时,PI3K/Akt通路受阻,VSMC由收缩型向合成型转变,增殖迁移能力增强,参与血管的重塑、增生等,最终使血管壁变厚、管腔狭窄、血管顺应性下降。同样地,VSMC发生表型转变向血管内膜迁移,参与动脉粥样硬化的形成。胰岛素受体(Insulin receptor,INR)是一种四聚体结构,分布于机体各种组织和细胞中。在胰岛素信号通路中,胰岛素首先通过与INR结合起作用,募集并磷酸化胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)以激活磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路或者激活异三聚体G蛋白,促进葡萄糖转运体4(glucose transporter-4,GLUT4)的合成。最终GLUT4转位到细胞膜上,引起葡萄糖转运和糖原合成等多种生物学效应。G蛋白偶联受体激酶2(G-protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)属于丝/苏氨酸激酶类。已有文献报道在IR状态下GRK2的表达升高,GRK2主要通过与INR和IRS结合,抑制下游胰岛素信号通路PI3K/Akt的转导,最终胰岛素摄取和利用葡萄糖的效率下降。由此可见,在胰岛素信号通路中,任一环节或信号分子发生障碍时,都会阻碍胰岛素信号正常转导,导致体内细胞摄取和利用葡萄糖的能力下降,引起DM。课题组前期对芍药苷(paeoniflorin,Pae)的结构进行酯化合成了芍药苷-6′-O-苯磺酸酯(paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25)。研究发现,白芍总苷(total glucosides of paeony,TGP)和CP-25具有免疫调节和抗炎等药理作用,TGP曾被应用于糖尿病肾病的治疗。课题组前期研究表明,CP-25的作用靶点为GRK2,但CP-25能否通过调节GRK2改善人主动脉平滑肌细胞(Human Aortic Smooth Muscle Cell,HASMC)的胰岛素信号通路及功能目前尚不清楚。因此,本文用C57小鼠构建T2DM动物模型。采用CP-25的高剂量给药,观察CP-25对糖尿病小鼠的糖代谢和相关指标的影响以及主动脉和心肌组织的病理变化。在体外实验中培养HASMC,以高浓度胰岛素诱导建立IR-HASMC模型,采用Transwell、免疫共沉淀和Western blot等技术,观察CP-25能否通过调控GRK2及下游胰岛素信号通路影响IR-HASMC的功能,及对INR与GRK2相互作用的影响,为揭示CP-25改善主动脉平滑肌损伤的机制提供依据。目的:1.明确GRK2通过胰岛素信号通路对糖尿病主动脉平滑肌细胞的影响。2.明确CP-25对IR-HASMC的影响及可能机制。方法:雄性C57BL/6J小鼠高糖高脂喂养6周后以70mg/kg的链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)连续腹腔注射4天,1周后测空腹血糖,空腹血糖值≥11.1mmol/l为造模成功。将成模小鼠分为正常组、模型组、二甲双胍组、格列齐特组、CP-25组、CP-25联合格列齐特组,每天灌胃给药1次,持续5周后给药结束,小鼠眼球取血后脱臼处死,检测小鼠的一般指标(血糖、体重)和IPGTT(Intraperitoneal glucose tolerance test);分离血清,ELISA法检测血清中INS(Insulin)、VEGF(Vascular endothelial growth factor)、TNF-α(Tumor necrosis factorα)、NO(Nitric oxide)、NOS(Nitric oxide synthase)的水平;取各组小鼠主动脉和心肌组织,HE染色观察各自的病理情况。以HASMC为研究对象,首先采用葡萄糖氧化酶法建立IR-HASMC模型;筛选出最佳胰岛素浓度。实验分为对照组、胰岛素(1μM)组、胰岛素(1μM)+CP-25(1n M、10n M、100n M、1μM、10μM)组和胰岛素(1μM)+Metformin(3 m M)组,CCK-8法检测细胞的活力;划痕和Transwell小室法检测的迁移功能;Hoechst/PI双染检测细胞的凋亡;Western blot法分别检测细胞中GRK2、INR、IRS、p-IRS、PI3K、GLUT4的蛋白表达;免疫共沉淀和激光共聚焦法检测GRK2与INR、GRK2与p-IRS的相互作用及共定位。结果:1.CP-25对糖尿病小鼠糖代谢、主动脉病理及其它相关指标的影响动物实验结果表明,CP-25联合格列齐特组较单独使用格列齐特降低小鼠血糖更明显,降低血清中TNF-α水平更明显,改善糖尿病小鼠糖耐量异常效果较好,升高血清中NO、NOS的水平,一定程度地改善主动脉组织的病理损伤。2.CP-25对IR-HASMC增殖、迁移及凋亡的影响HASMC发生IR时,增殖和迁移能力增强,凋亡受到抑制。CP-25可以抑制细胞的增殖和迁移,促进细胞的凋亡。3.CP-25对IR-HASMC中GRK2、INR、IRS、p-IRS、PI3K、GLUT4表达的影响HASMC发生IR时,GRK2的总表达和胞膜表达均比正常细胞高,INR、p-IRS、PI3K的表达和GLUT4的胞膜表达比正常细胞低。CP-25可以下调GRK2的胞膜表达,上调INR、p-IRS、PI3K的表达和GLUT4的胞膜表达。4.CP-25对IR-HASMC中GRK2与INR、GRK2与p-IRS共表达的影响胰岛素作用后上调HASMC中GRK2与INR、GRK2与p-IRS的共表达,CP-25可以下调GRK2与INR、GRK2与p-IRS的共表达。结论:1.CP-25可以改善T2DM小鼠的糖耐量异常,下调相关炎症因子的表达,改善主动脉组织的受损情况。2.胰岛素上调HASMC中GRK2与INR的共表达,提示IR时,GRK2发生过度转膜,可能与INR脱敏有关;胰岛素上调HASMC中GRK2与p-IRS的共表达,提示GRK2升高可以抑制IRS的酪氨酸磷酸化水平,抑制胰岛素信号通路的转导,提示胰岛素信号受到抑制从而促进HASMC的增殖和迁移。3.CP-25下调HASMC中GRK2与INR、GRK2与p-IRS的共表达,提示CP-25可能通过抑制GRK2的过度转膜和GRK2的蛋白表达,下调GRK2对胰岛素信号转导的抑制作用,可能是其抑制HASMC增殖和迁移的机制之一。