背景系统性硬化（Systemic sclerosis,SSc）是一种相对少见的自身免疫紊乱介导的弥漫性结缔组织病,以受累组织和器官进行性纤维化为主要特征,其中肺部是最常见和最重要的受累器官,以肺纤维化表现常见,已成为SSc患者死亡的主要原因。目前对SSc相关肺纤维化的治疗仍然是以糖皮质激素联合免疫抑制剂为基础,然而,这一基础方案的治疗效果是相当有限的。因此,积极寻找新的治疗药物并阐明其治疗机制是一个迫切而重要的课题。二肽基肽酶4（Dipeptidyl peptidase 4,DPP4）,是一种II型跨膜糖蛋白,具有丝氨酸蛋白酶活性,能够催化水解多肽及蛋白质N端倒数第2位为丙氨酸或者脯氨酸的底物。常见底物包括多种趋化因子、神经肽Y、肠促胰岛素、胰高血糖素样肽-1等。目前已有多种DPP4制剂被批准用于糖尿病的治疗。研究显示DPP4也有促进纤维化的作用,并且DPP4抑制剂在某些纤维化动物模型中表现出明显抑制纤维化的作用,但是相关机制未完全阐明。目的探讨DPP4抑制剂利格列汀对SSc小鼠模型肺纤维化的治疗作用和机制。第一部分SSc合并肺纤维化小鼠模型的建立方法:将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为5组,每组6只,分别为正常对照组及博来霉素分别为1.25mg/kg组、2.5mg/kg组、5mg/kg组和10mg/kg组。正常对照组以无菌注射针头于小鼠背部中央区皮下注射磷酸缓冲液（PBS）0.1ml,其余各组分别在小鼠背部相同部位注射用PBS稀释的相应剂量博来霉素溶液各0.1ml,每天1次,连续28天。分别记录各组小鼠的一般状态、体重和死亡情况。至给药结束后,取存活小鼠注射部位背部皮肤和左肺组织分别行HE染色和Masson染色,并以Ashcroft评分进一步评价肺纤维化程度。结果:1.随着博来霉素皮下注射剂量的增加,小鼠的一般情况逐渐变差,体重减轻趋势逐渐明显,死亡率也逐渐增高。2.皮肤组织HE染色结果显示,正常对照组小鼠皮肤表皮层、真皮层、脂肪层、肌肉层未见明显结构变化。博来霉素1.25mg/kg组小鼠皮肤真皮层略有增厚,胶原纤维稍变粗,脂肪层未见明显变化。当博来霉素剂量达2.5mg/kg时,皮肤真皮层开始明显增厚,胶原纤维明显增多、增粗,排列变紧密,随着剂量进一步增加,上述改变程度进一步加重,皮下脂肪层明显变薄,甚至消失。3.皮肤组织Masson染色显示,正常对照组可见少量蓝色胶原纤维,随剂量增加,胶原纤维开始增多,当剂量达到2.5mg/kg时,胶原纤维较正常对照组有较明显的增多,随着剂量进一步加大,胶原纤维进一步增多。4.肺组织HE染色显示,随剂量增加,肺泡组织破坏、肺泡间隔增厚程度逐渐增高,肺纤维化范围逐渐增大,当剂量达到2.5mg/kg时,开始见肺组织有局部纤维化实变表现,当剂量为5mg/kg、10mg/kg时,肺组织均出现大片纤维化表现。肺纤维化Ashcroft评分显示,当剂量达到2.5mg/kg时,较正常对照组开始出现明显差异。5.肺组织Masson染色显示,胶原沉积程度与博来霉素剂量呈正相关,当博来霉素剂量为5mg/kg、10mg/kg时,肺组织均可见大片蓝色胶原纤维沉积。这两种剂量均可成功诱导明显的肺纤维化。第二部分利格列汀对SSc小鼠肺纤维化的保护作用及初步机制探讨方法:将32只周龄为6-8周、体重为20-22g的C57BL/6雌性小鼠随机分为4组,每组8只。分别为正常对照组、博来霉素组、博来霉素+利格列汀组、博来霉素+雷帕霉素组。博来霉素剂量为5mg/kg,每天1次,连续4周。利格列汀和雷帕霉素给药剂量分别为10mg/kg和1.5mg/kg,于博来霉素给药1周后开始,灌胃给药,每天1次,持续至实验结束。实验开始后,每日观察各组小鼠一般情况并记录小鼠体重。至实验终点,取小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）,测定白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。取右肺组织,利用相应试剂盒测定其羟脯氨酸、总超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量。取左肺组织,进行HE染色和Masson,并以Ashcroft评分进一步评价纤维化程度。结果:1.与正常对照组相比,博来霉素组小鼠一般情况逐渐变差,体重明显减轻,经利格列汀、雷帕霉素干预后后,小鼠一般情况和体重减轻情况均有所好转。2.与正常对照组相比,博来霉素组小鼠肺组织HE染色显示肺组织正常结构严重损毁,肺泡结构严重破坏,肺泡间隔明显增厚,大部分肺泡腔融合、消失,代之以大片状纤维灶结构,利格列汀、雷帕霉素干预组肺泡间隔增厚情况相比于博来霉素组明显好转,但较对照组仍有增厚。视野大部可见肺泡结构,局部仍有肺泡腔融合消失现象,局部小片状纤维灶。肺纤维化Ashcroft评分博来霉素组明显高于正常对照组,利格列汀、雷帕霉素干预组较博来霉素组明显降低,但较正常对照组仍有明显升高。3.与正常对照组相比,博来霉素组小鼠肺组织Masson染色可见肺组织出现大量弥漫性、分布不均匀的蓝色胶原纤维沉积。利格列汀、雷帕霉素干预组小鼠肺组织与博来霉素组相比,蓝色胶原纤维分布明显减少。羟脯氨酸含量检测显示博来霉素处理后明显升高,利格列汀、雷帕霉素干预组较博来霉素明显减低,但仍高于正常对照组。4.与正常对照组比较,博来霉素组小鼠BALF液中TNF-α、IL-6水平均显著升高,予利格列汀或雷帕霉素干预后,上述炎性因子水平均明显下降,但较正常对照组相比,仍明显升高。5.博来霉素组小鼠肺组织SOD活性明显降低,MDA水平明显上升,予利格列汀或雷帕霉素干预后,SOD活性明显回升,MDA水平明显下降,但上述指标改变均较正常对照组仍有明显差异。第三部分利格列汀通过抑制内皮间质转化抑制SSc小鼠肺纤维化方法:1.细胞实验:采用CCK-8试剂盒分别测定博来霉素、利格列汀、雷帕霉素对脐静脉内皮细胞（HUVECs）活力的影响,以确定合适的药物处理浓度。实验设置正常对照组、博来霉素组、博来霉素+利格列汀组、博来霉素+雷帕霉素组。通过不同组别细胞形态学改变、细胞骨架改变、以及Western blotting和RT-q PCR、免疫荧光双染法检测不同组细胞内皮间质转化相关标记蛋白和相关转录因子的表达情况,评估不同组细胞内皮间质转情况。通过划痕试验和细胞迁移实验评估不同组细胞迁移能力变化。2.动物实验:动物实验分组及处理同第二部分。采用组织免疫荧光双染、免疫组织、Western blotting等试验检测不同组小鼠肺组织内皮间质转化标记蛋白和转录因子变化。不同组小鼠肺组织Akt、P-Akt、m TOR、P-m TOR表达情况以Western blotting法检测。结果:1.当博来霉素、利格列汀、雷帕霉素浓度分别达到4μg/ml、200n M、400n M时,对HUVECs细胞活力产生明显影响,故实验中上述药物干预浓度分别定为2μg/ml、100n M、200n M。2.博来霉素刺激48h后,HUVECs细胞由鹅卵石样向梭型转变。免疫荧光染色显示细胞骨架发生重构,出现典型的纤维样结构改变。利格列汀或雷帕霉素干预后,上述改变被抑制。3.博来霉素刺激48h后,内皮细胞标记蛋白和基因CD31、VE-Cadherin表达明显下降,间质细胞标记蛋白和基因α-SMA和I型胶原明显上升。内皮间质转化（End MT）相关转录因子Snail、Slug、Twist蛋白和基因表达上升。经利格列汀或雷帕霉素干预后,上述相关蛋白和基因转变趋势被抑制。4.博来霉素刺激后,HUVECs细胞迁移能力明显增强,利格列汀或雷帕霉素干预后,其迁移能力被明显抑制。5.博来霉素组小鼠肺组织血管内壁内皮细胞标记蛋白CD31表达明显降低,间质细胞标记蛋白α-SMA表达明显升高,End MT相关转录因子Slug表达也明显升高,总VE-Cadherin表达下降,而I型胶原表达上升,经利格列汀或雷帕霉素干预后,上述蛋白表达改变趋势被抑制。6.博来霉素组小鼠肺组织中P-Akt和P-m TOR蛋白表达相比正常对照组明显上升,经利格列汀或雷帕霉素干预后,上述蛋白表达上升趋势被抑制。结论:1.5mg/kg剂量的博来霉素皮下注射可以成功诱导系统性硬化症相关肺纤维化小鼠模型,同时死亡率相对低,成模率高。2.利格列汀可显著抑制系统性硬化症小鼠模型的肺纤维化表现,这一抑制作用与其对炎症和氧化应激的抑制效应有关。3.利格列汀通过抑制Akt/m TOR信号通路的激活,抑制End MT,并进一步抑制SSc小鼠肺纤维化。