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禽流感(avian influenza, AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类传染性疾病,高致病性禽流感病毒(high pathogenic avian influenza virus, HPAIV)在禽群(尤其是家禽)中可引起急性发病,甚至大量死亡,给养殖业造成巨大的损失。自1997年发生H5N1亚型禽流感病毒跨越种间屏障传染人以来,该病毒的相关研究备受关注并深入展开。目前,禽流感疫苗设计的焦点主要是能诱导产生中和抗体的病毒表面抗原血凝素(hemagglutinin, HA)和神经酸酶(neuraminidase, NA),而对其内部蛋白尤其是核蛋白(nucleoprotein, NP)相关的细胞免疫研究相对较少。本研究以禽痘病毒( fowlpox virus, FPV )表达系统为基础,将H5N1 AIV A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) (GD1/96)株NP全长分节段克隆至该系统,探寻其中是否存在T细胞表位。采用不同的引物对将NP全长分成6个截短片断,每个片段为140个氨基酸左右的肽段,各片断前后重叠70个氨基酸,PCR扩增后分别克隆至载体pSY538,同时在目的基因表达框下游引入LacZ表达盒便于后续重组毒筛选,然后将目的基因及LacZ表达元件整体酶切后连入禽痘病毒表达载体pSY638,最终获得重组质粒pSY-NPn-LacZ (n=1, 2, 3, 4, 5, 6)。将所获得的6个重组质粒分别转染预先感染过禽痘病毒S-FPV-017株的原代CEF,3-5d后待细胞出现80-100%细胞病变(CPE)时收获细胞及上清,冻融3次后采用噬斑纯化法通过蓝斑筛选获得并纯化含有NP各片段的重组痘病毒,随后在CEF上滴定各重组痘病毒滴度。结果表明成功获得片断1,3,4,5的重组禽痘病毒,分别命名为rFPV-NP1,rFPV-NP3,rFPV-NP4和rFPV-NP5,且其滴度均在2×10~6 pfu/mL左右。为了能在体内诱导SPF鸡产生针对AIV NP的记忆性T细胞,本研究将NP基因从重组质粒pVAX-NP上酶切后亚克隆至含禽源启动子的真核表达载体pCAGGS中,经筛选鉴定后获得重组子pCAGGS-NP。鉴定正确的阳性重组子体外转染真核细胞后,利用间接免疫荧光检测目的基因的瞬时表达状况;确定该重组质粒能正确表达NP后,将其以100μg/羽的剂量腿部肌肉注射免疫SPF鸡,同时设立空载体及空白免疫对照组,在二免三周后使用AIV A/Chicken/Heilongjiang/35/00(H9N2)弱毒株进行加强,利用ELISA检测免疫后血清抗NP蛋白抗体效价,检测结果表明,该重组质粒能在SPF鸡体内诱导产生针对AIV NP的抗体,抗体效价在加强免疫和弱毒感染后迅速提高,根据DNA疫苗诱导机体产生的免疫效应的原则可知免疫鸡体内同样产生了相关的细胞免疫反应。为了给各NP片段在活化的鸡淋巴细胞中诱导所产生的T细胞反应提供一种确实有效的检测评价方法,本研究经RT-PCR方法从ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的总RNA中扩增得到鸡γ-干扰素(Chicken interferon-γ,ChIFN-γ)和鸡的28S rRNA(Ch28S)的基因,将其分别克隆至体外转录载体后经体外转录获得了ChIFN-γ和Ch28S的RNA。然后将体外转录的ChIFN-γ和Ch28S RNA测定浓度后按10倍梯度稀释制作标准品,采用各自的特异性引物及Taqman探针,以Ch28S RNA作为内参进行一步法实时定量RT-PCR检测ChIFN-γ。结果显示,ChIFN-γ和内参Ch28S的Ct值与标准品稀释梯度在1×10~2-1×10~7 copies/μL之间分别呈现出良好的线性关系,R2均大于0.99。建立了准确评价ChIFN-γ表达水平的实时荧光定量RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR)方法。待加强免疫的SPF鸡感染禽流感弱毒株4天后,将其各组SPF鸡处死并采集脾脏,分离脾淋巴细胞,分别采用一定剂量的rFPV-NP1、rFPV-NP3、rFPV-NP4和rFPV-NP5进行体外刺激培养。18h后分别收集培养上清和细胞,采用ELISA试剂盒检测培养上清中ChIFN-γ分泌量,一部分细胞用于荧光定量RT-PCR检测ChIFN-γ基因转录状况,另一部分细胞采用流式细胞术对刺激培养后细胞中CD8+T细胞增殖情况进行检测,检测结果一致显示rFPV-NP5能刺激NP活化的鸡淋巴细胞IFN-γ基因转录水平提高、ChIFN-γ分泌量明显增加,CD8+T细胞含量显著提高。表明在AIV GD1/96 NP的第5片断即NP277-421能诱导产生较强的细胞免疫反应,可能存在T细胞表位。