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家蚕(Bombyx mori)是卵滞育性鳞翅目模式昆虫,受亲代卵孵化期(催青期)温度、光节律等环境因子诱导,并受产下后温度诱导决定表现。本文以经典的家蚕滞育卵诱导条件催青期蚕卵及胚后幼虫与蚕蛹,调查家蚕滞育激素基因dh、滞育特征能量代谢限速酶山梨醇脱氢酶基因sdh、家蚕滞育生物钟蛋白基因ea4以及家蚕抗氧化酶基因sod和过氧化氢酶基因cat的表达谱,从滞育诱导与活化调控相关基因表达与环境互作的角度研究了家蚕活化的分子机制。主要获得了以下结果:1家蚕5个滞育相关基因的表达存在显著的组织和性别差异性家蚕大造品种5龄幼虫期基因芯片表达谱显示,dh基因、sdh基因和cat表达水平存在性别差异与组织差异,雌蚕的多个组织dh基因表达水平都显著低于雄性;雄蚕的sdh基因表达丰度显著高于雌蚕,而卵巢的sdh基因表达丰度高于精巢;cat基因除在卵巢的表达水平高于精巢外,其它组织的表达量都低于雄性。ea4基因、sod基因和cat基因在不同组织中的表达有显著差异性,ea4基因和sod基因在后部丝腺都只有痕迹量表达,而表达丰度最高的组织分别为头部和体壁,cat则在不同组织中的表达有极显著的差异性。10个家蚕品种的ESTs表达谱分析显示,ea4基因表达具有组织(器官)和发育时期的差异性,前胸腺表达最高,而生殖腺没有表达;成虫期表达量显著高于其它发育时期,其中刚羽化成虫的前胸腺与被微生物感染5龄幼虫的脂肪体中ea4基因表达丰度显著上调。2诱导子代滞育卵发生的高温与光照条件上调家蚕dh基因表达催青期在诱导子代滞育卵发生的高温25℃与持续光照条件下,蚕卵有稳定的、高水平dh基因mRNA存在,而诱导子代非滞育卵发生的低温15℃与持续黑暗条件下,蚕卵中几乎检测不到dh基因的mRNA存在。在25LL或者20LD催青环境中,胚胎发育至单眼形成后(积温高于2160℃·h),蚕卵中的dh基因表达水平开始显著上调,这与在此阶段的蚕卵胚胎对滞育诱导环境温度和光节律更加敏感相一致,但dh基因表达水平没有出现随不同滞育诱导温度或光节律变化的振荡节律,表明蚕卵胚胎的dh基因表达受到滞育诱导温度和光照这两个近日节律授时因子的影响,但不是节律授时因子直接调控的基因。从催青期开始的整个世代保护温度和光照,对家蚕胚后时期dh基因的表达水平影响,呈现高温25℃上调dh基因的表达。亲代卵孵化期的催青温度与光照,影响了子代卵的滞育性,也影响了子代卵内的dh基因mRNA水平,但这种影响与蚕卵的滞育性不完全一致。3亲代卵高温环境催青能够下调家蚕整个世代sdh基因表达催青期的25℃高温和持续光照,显著下调蚕卵sdh基因表达;在20LD催青条件下,蚕卵sdh基因灵敏地受到滞育诱导温度和光照这两个近日节律授时因子的影响,但没有出现随不同滞育诱导温度变化的振荡节律;整个世代维持在诱导子代卵发生滞育的25LL环境下,幼虫至蚕蛾时期各阶段体内(生殖腺)sdh基因的表达水平总体低于20LD环境;亲代不同温度孵化处理结果表明,25℃条件下子代卵在孵化后期进入滞育,sdh基因的转录水平也随之降低。4光照对该环境中的蚕卵和子代卵的sdh基因表达影响不同亲代卵催青期低温条件下的持续光照,有显著下调蚕卵sdh基因表达的作用;亲代催青期低温条件下的持续光照,有上调子代卵sdh基因表达的作用。催青期光照对处于该光照环境中的亲代蚕卵和子代卵的sdh基因表达影响呈现相反的结果。5家蚕TIME-EA4的滞育生物钟活性不依赖基因表达水平的上调虽然催青期在15DD环境中,蚕卵ea4基因转录水平显著低于25LL和20LD环境,但温度和光照节律的振荡改变,没有出现相应的蚕卵胚胎的ea4基因转录水平变化。胚后时期家蚕幼虫与蚕蛹的ea4基因具有发育阶段与组织(器官)的显著表达差异,在不同滞育诱导环境之间也有差异,但与滞育诱导发生条件无明显关联,而是与自由基代谢相关。子代卵滞育发生和活化过程中ea4基因的表达结果显示,授精前(处女蛾卵)都具有高水平ea4 mRNA存在,而授精后0.5 h-12 h迅速被降解;合子形成后,转录本水平逐渐升高,滞育性卵在卵龄12 h、无滞育性卵在卵龄24 h后达到授精前水平,并在24 h-72 h的滞育发生期,以及72 h以上的滞育完成期,一直维持此水平,也无滞育性差异。盐酸活化处理卵龄24 h的滞育性卵,卵内EA4的ATPase活性在处理后1.5 h左右出现;5℃低温冷藏卵龄48 h的滞育性卵,活性则在冷藏13d左右出现,但这2个过程都没有检测到ea4基因转录水平升高。提示家蚕滞育性卵活化启动时的EA4生物钟活性出现不依赖ea4基因表达。6棉铃虫ea4同源基因的克隆、分子进化及组织表达Haea4基因全长cDNA 799bp,编码199个氨基酸。蛋白序列分析表明,Haea4分子量18768.88,等电点5.45。Haea4基因有明显的信号肽序列,属于分泌蛋白。含有Cu/Zn SOD核心结构域、N-糖基化位点、N-酰基化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点。蛋白同源性分析结果表明,HaEA4在不同物种中的保守性较高。分子进化分析表明,棉铃虫和家蚕、野桑蚕的TIME-EA4同源蛋白质都与Cu-Zn/SOD蛋白的进化距离较近,蛋白质二级结构分析也显示,棉铃虫与家蚕的TIME-EA4基本特性有很大相似性。该基因在棉铃虫不同组织中的表达有一定差异,中肠、脂肪体、体壁表达量较高,头部、生殖腺、丝腺表达量相对较低,提示Haea4基因的分布与酯酶发挥代谢解毒的功能是一致的。氨基酸遗传距离和同源性分析表明,棉铃虫的TIME-EA4与家蚕和野蚕间的遗传距离分别为0.536,0.548,同源性均为44%。7滞育诱导温度和光节律对家蚕抗氧化酶基因sod和过氧化氢酶基因cat表达谱的影响催青期25LL环境,蚕卵sod基因表达除孵化时显著下调外,其它时期有高水平的sod mRNA存在;20LD催青环境,蚕卵sod基因表达量高于15DD,在孵化后期胚胎神经系统发育完全后更加显著;cat基因在25LL、20LD和15DD环境之间的表达量没有显著差异,孵化后期(积温2160-3600℃·h),cat基因表达水平显著上调,这与在此阶段的蚕卵胚胎对滞育诱导环境温度和光节律更加敏感相一致。sod基因在人工活化卵中的表达水平显著高于非浸酸的滞育性卵;卵龄24-192h,25LL条件下子代卵逐渐进入滞育,sod基因表达量下调;温度和光照对家蚕子代卵期sod基因的表达水平影响,呈现低温黑暗上调sod基因的表达。cat基因在人工活化卵初期mRNA水平下降,低于滞育性卵,卵龄72h转录水平开始上调,96h时接近滞育性卵,提示盐酸活化抑制了初期家蚕CAT活性。亲代15℃恒温环境,黑暗条件下的子代卵cat基因表达水平一直高于光照条件,光照与温度协同处理时,20LD处理,子代卵中cat基因表达水平总体低于25LL和15DD环境。