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地鳖虫(Eupolyphaga sinensis Walker,ESW)在中医上叫土元,隶属于鳖蠊科。《中华人民共和国药典》记载地鳖为传统的理血伤科的中药药材。研究表明,地鳖提取物具有抗血栓血脂、抑制肿瘤、免疫保护、抗氧化、促骨折愈合等功效,地鳖虫提取成分之一地鳖肽,具有一定的清除自由基,提高抗氧化酶活性,抗衰老损伤等药理活性,但其作用机制尚未见报道。本研究拟以地鳖虫为材料,通过蛋白酶解和纯化法提取地鳖肽(ESWpeptides,ESWPs),建立肝损伤模型,探讨探讨地鳖肽对其保护作用及可能机制,预期研究成果为地鳖肽开发为抗氧化保护药提供实验依据。(1)实验一目的提取纯化及鉴定地鳖肽,为对其抗氧化保护作用的研究奠定物质基础。取地鳖虫粉碎,采用酶解法提取地鳖肽,通过超滤、离子层析、凝胶层析法分离纯化地鳖肽,然后检测地鳖肽对自由基清除力、Tricine-SDS-PAGE检测其分子大小。结果提取的地鳖肽浓度为20.67mg/ml,提取率达16.8%,对羟自由基清除可到42.03%,地鳖肽分子量小于10KDa左右。结果表明制备获得小分子地鳖肽,其具有良好的清除自由基能力。(2)实验二目的探讨地鳖肽对CCl4致急性肝损伤小鼠的保护作用。取小鼠随机分正常组、模型组、阳性药物组、不同剂量地鳖肽组(50、100、200mg/kg)。地鳖肽组和模型组小鼠每天一次灌胃地鳖肽连续7天,同样方法正常组小鼠灌服等量生理盐水、药物组小鼠灌服水飞蓟素(100 mg/kg),然后除正常组所有小鼠腹腔注射CCl4,18小时后小鼠称重、采血制备血清,处死小鼠取肝脏,分别采用分光光度法、ELISA、RT-PCR检测小鼠肝功能指标、抗氧化酶活力、过氧化物含量、炎症因子蛋白和基因表达指标,HE染色观察肝结构。结果与正常组比较,模型组小鼠AST、ALT活力明显升高,抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活力显著下降、MDA含量明显增加,炎症因子(IL-6、TNF-α、iNOS)蛋白与基因水平表达均显著升高;小鼠脏器指数显著升高;小鼠肝组织中央静脉和汇管区有大量红细胞,肝细胞脂肪变性。与模型组比较,地鳖肽组的小鼠血清中AST、ALT活力显著降低,肝组织中SOD、CAT、GSH-Px活力显著升高、MDA含量明显降低,炎症因子(IL-6、TNF-α、iNOS)蛋白与基因表达水平均显著降低;小鼠脏器指数显著降低;组织结构显微镜观察,结果阳性药物组和地鳖肽组小鼠肝细胞排列整齐,无明显细胞坏死和脂肪变性。与模型组比较,阳性药物组小鼠各项指标与地鳖肽组结果趋势一致。结果表明,地鳖肽能明显降低小鼠肝功能指标、增强肝组织的抗氧化酶活力、降低过氧化物生成、减少炎症因子产生,说明地鳖肽对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤有一定保护作用。(3)实验三目的探讨地鳖肽对CCl4致肝损伤小鼠的保护作用机制。取小鼠随机分正常组、模型组、药物组、地鳖肽组。地鳖肽组和模型组小鼠每天灌胃灌服一次地鳖肽连续灌服6周,同样方法正常组小鼠灌服等量生理盐水、药物组小鼠灌服水飞蓟素,然后除正常组所有小鼠每周2次腹腔注射CCl4,采用分光光度法检测小鼠肝酶指标,ELISA和RT-PCR检测炎症因子、凋亡因子和纤维化因子基因蛋白和表达,HE染色观察肝组织结构。结果与正常组比较,模型组小鼠脏器指数显著升高,肝组织结构观察小鼠肝组织中央静脉和汇管区有大量红细胞,大量肝细胞坏死和凋亡,肝细胞索破坏,肝组织有纤维化现象;AST、ALT活力明显升高,抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活力显著下降、MDA含量显著增加,炎症因子(IL-6、TNF-α、iNOS)蛋白与基因表达水平均显著升高;促凋亡因子(Bax、Caspase-3)基因表达显著升高、抑制凋亡因子(Bcl-2)表达明显降低;纤维化因子TGF-β1、α-SMA基因表达显著升高。与模型组比较,地鳖肽组小鼠脏器指数显著减低,肝细胞核清晰,细胞排列整齐,中央静脉无红细胞;AST、ALT活力显著降低,SOD、CAT、GSH-Px活力显著升高、MDA含量明显降低,炎症因子(IL-6、TNF-α、iNOS)蛋白与基因表达水平均显著降低;促凋亡因子(Bax、Caspase-3)基因表达显著降低、抑制凋亡因子(Bcl-2)表达明显升高;纤维化因子TGF-β1、α-SMA基因表达显著降低。与模型组比较,阳性药物组小鼠各项指标与地鳖肽组结果趋势一致。结果表明,地鳖肽能改善肝组织形态结构,恢复肝功能,提高肝脏抗氧化能力,减轻炎症及抑制肝脏凋亡和纤维化,提示其对组织慢性肝损伤有保护作用,其机理可能通过降低炎症因子产生,抑制凋亡因子和纤维化因子表达调控肝功能。综上所述,本研究获得小分子量地鳖肽,其对肝损伤的小鼠有一定保护作用是通过提高抗氧化酶活力、减少过氧化物产生、降低炎症因子,其机理可能与抑制凋亡、降低纤维化有关。