目的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的脓毒症(sepsis)发病率处于上升趋势,病死率超过50%;一旦发生,早期液体复苏、抗生素治疗、代谢支持及重要器官辅助性治疗并不能显著降低死亡率。越来越多的研究显示G+细菌与G-菌所致sepsis存在显著区别,已发现肠毒素超抗原(superantigen)作用与金黄色葡萄球菌脓毒症发病存在密切关系。但临床研究却难以证实这一点,一个最重要的原因是缺乏在体评价超抗原效应的可靠指标。为此,我们应用肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B ,SEB)诱导培养的人外周血T淋巴细胞,较全面观察T淋巴细胞在超抗原作用下的活化规律,包括T淋巴细胞在SEB诱导后趋化因子受体的改变、与炎症作用相关的细胞因子分泌的变化规律及超抗原增殖特点;随之观察了SEB活化后T细胞释放的细胞因子对肺动脉内皮细胞趋化因子释放的影响;将SEB活化T淋巴细胞与人肺动脉内皮细胞共培养,观测活化的T细胞对人肺动脉内皮细胞的趋化、粘附以及损伤作用;使用趋化因子拮抗剂观察其保护人肺动脉内皮的效果,进一步证实肠毒素超抗原是通过活化T淋巴细胞的直接粘附对内皮细胞致损,其中趋化行为的改变是超抗原活化后的T细胞产生全身炎症反应的关键因素。期望通过本研究,阐明金黄色葡萄球菌分泌的肠毒素通过超抗原机制参与脓毒症的发病,T细胞趋化行为的改变可能作为金黄色葡萄球菌sepsis的早期标志,调节T细胞趋化行为可以作为临床防治工作的思路。研究内容和方法第一部分:肠毒素B超抗原活化T细胞的规律研究应用不同浓度SEB处理人外周血T淋巴细胞,观察T淋巴细胞在SEB诱导下随时间变化的活化规律。观察指标分为早期和中后期两部分:早期应用RT-PCR和流式细胞仪检测T淋巴细胞趋化因子受体CCR2,CCR3,CCR5的转录、表达水平;应用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法观察T细胞培养上清中淋巴因子IL-2,IL-10,TNFα,IFNγ随时间和SEB刺激浓度变化规律;后期根据预试验并参照报道文献结果,从SEB诱导后3天开始,分别于3、5、7、9天时间段收获细胞,分别应用TCR Vβ亚族混合抗体标记T细胞流式细胞仪和MTS法检测SEB诱导后T淋巴细胞增殖反应。第二部分:肠毒素SEB活化的T细胞对人肺动脉内皮细胞的损伤作用观察及损伤机制研究1、10ng/ml SEB活化后的T淋巴细胞上清稀释不同浓度后,加入完全贴壁的人肺动脉内皮细胞平板内,ELISA方法检测内皮细胞趋化因子MCP-1、MIP-1α、Rantes的分泌情况;细胞免疫组化法观察内皮P选择素和ICAM-1的表达; TRANSWELL小室观察内皮细胞分泌的趋化因子对T细胞趋化的影响,同时加入T细胞趋化作用拮抗剂Met-Rantes,观察其抑制作用;10ng/ml SEB刺激的T细胞与人肺动脉内皮细胞共培养,检测T细胞与内皮细胞的粘附率,收集下层与内皮细胞粘附的T细胞,胰酶消化后,应用流式细胞仪检测CD4和CD8 T淋巴细胞CCR5的表达情况。2、分别将10ng/ml SEB、其刺激的T细胞培养上清或T细胞加入到人肺动脉内皮细胞平板内共培养8h后,采用荧光定量RT-PCR的方法检测内皮细胞水通道AQP1的表达、TUNEL原位检测内皮细胞凋亡、细胞免疫组化观察内皮P选择素和ICAM-1的表达;应用T淋巴细胞趋化因子拮抗剂Met- Rantes,观察Met- Rantes对内皮细胞的保护作用。研究结果第一部分:肠毒素B超抗原活化T细胞的规律研究1、与空白对照组相比,SEB刺激PBMC 2天后,倒置显微镜就可以观察到T细胞开始增殖,而MTS法和TCR Vβ亚族混合抗体标记T细胞流式细胞仪检测T细胞增殖时却需要在细胞培养第5天后才检测到明显的细胞增殖,后法可以同时显示T细胞增殖发生在特异的TCR Vβ3、TCR Vβ17、TCRVβ14亚族。2、荧光定量RT-PCR和流式细胞仪检测显示:SEB刺激的T细胞早期(8h)出现CCR2的下调表达,CCR3没有显著改变;但CCR5的表达在各SEB浓度组都出现显著上调表达。.3、ELISA方法检测细胞因子的结果显示:(1)IL-2在12小时后随SEB刺激浓度增加,分泌增多,24小时达峰值。(2)TNF-α的变化出现较晚,12小时后出现TNF-α分泌增加,100ng/ml SEB组72小时较对照组TNF-α分泌增加7倍(2300/322.5);72小时各组间TNF-α分泌显示出随浓度改变的显著差异。(3)IFN-γ的分泌在各SEB组的变化均出现较早,12小时各组均较对照组IFN-γ的分泌增加,并显示随浓度变化的组间差异,其后各组IFN-γ的分泌均快速增加。(4)IL-10的分泌在1-100ng/mlSEB刺激作用下也是随浓度增加而升高的,但12小时内各组间IL-10的分泌没有显著差异,24小时,3组SEB刺激的T细胞同时出现IL-10分泌的显著增加。第二部分:肠毒素SEB活化的T细胞对人肺动脉内皮细胞的损伤作用观察及损伤机制研究1、不同浓度的T细胞培养上清刺激的HPAEC都表现出趋化因子随刺激时间延长而增加释放的趋势,其中Rantes表现出早期(6h)快速释放和后期(12、24、48、72h)延迟释放特点;与10ng/ml SEB组相比,1×T细胞上清在各时段的MCP-1、MIP-1α、Rantes释放均有显著增加,MCP-1、Rantes的增加尤为显著:MCP-1在6h和72小时分别增加了17倍和22倍(1200±68 vs69±6;6500±500 vs 303±8);Rantes在6h和72小时分别增加了33倍和140倍(3600±138 vs 114±7;15700±1300 vs116±12)。比较不同浓度T细胞上清与HPAEC趋化因子释放的量效关系可以看到,MCP-1、Rantes的释放还随T细胞上清中细胞因子的浓度增加而增加,但即使将T细胞上清稀释100倍,MCP-1、Rantes这两种趋化因子的释放在各时段也是比单独应用SEB刺激的HPAEC显著增加,MIP-1α的水平在1/100×T细胞上清与10ng/ml SEB组间24小时内没有显著差别,但48h和72h后,1/100×T细胞上清组的MIP-1α释放增高,与10ng/ml SEB组相比,差异有显著意义(230±11 vs75±10,P<0.01;210±15 vs70±6,P<0.01)。2、多组T细胞Transwell试验,可以看到与未经SEB作用的对照组相比,趋化因子组上室的T细胞趋化因子受体没有上调,但下室的HPAEC上清因受到SEB活化T细胞细胞因子的刺激而具有较高含量的趋化因子,这组中的T细胞从上室趋化移动至聚碳酸酯膜的数量显著增多(71.00±6.13 vs 16.50±2.50;P<0.01);趋化因子受体组上室的T细胞趋化因子受体上调,但下室的HPAEC上清T细胞趋化因子没有增加,这组中向下室趋化的T细胞数量也显著增多(50.88±6.56 vs 16.50±2.50;P<0.01);相比而言,超抗原组上室的T细胞趋化因子受体上调,下室的HPAEC上清趋化因子也是增加的,这组中的T细胞趋化作用增加最为显著(86.38±14.50 vs 16.50±2.50;P<0.01)。与超抗原组相比,Met-Rantes组向下室趋化T细胞数量下降(42.38±6.67 vs 86.38±14.50;P<0.01)。3、镜下可以观察到在10ng/ml SEB诱导的PBMC与HPAEC共培养的超抗原组中,24小时T细胞黏附率增加(接近10倍),差异有统计学意义(15.5±1.08 vs 1.60±0.22;P<0.01);与超抗原组相比较,加入1ug/ml Met-Rantes组T细胞黏附率显著下降(4.39±0.66 vs1.60±0.22;P<0.01)。用胰蛋白酶处理收集黏附的T细胞进行流式细胞仪检测T细胞CCR5的表达,可以发现黏附到下层HPAEC的T细胞CCR5+/CD4+细胞占CD4的52.30±4.45%; CCR5+/CD8+占CD8的48.05±3.66%。与第一部分实验中100ng/ml SEB诱导3天的PBMC相比,CCR5+/CD4+的百分比增加了3倍(52.30±4.45% vs 14.8±1.02),CCR5+/CD8+的百分比增加了4倍(48.05±3.66 vs 12.6±1.31)。4、超抗原组的HPAEC在与10ng/ml SEB诱导3天后的PBMC共培养8小时,细胞大小和形态方面均发生明显改变,部分细胞胞核体积增大、形态变得不规则,24小时出现内皮细胞脱落现象,表现为间隙扩大,48小时细胞脱落更加明显,贴壁细胞数量明显减少。TUNEL方法显示,与正常培养的HPAEC组比较,超抗原组HPAEC细胞凋亡指数明显增加(32.50±4.50 vs3.50±0.50,P<0.01);部分视野下,可以发现凋亡的HPAEC细胞旁有小细胞核的T细胞粘附。SEB组、T细胞组与对照组相比,凋亡指数没有改变;上清组的凋亡指数虽有增加趋势,但没有显著统计学差异(5.25±1.25vs3.50±0.50,P=0.089)。将1ug/ml的Met-Rantes提前加入到HPAEC培养液中,与超抗原组比较,Met-Rantes组的细胞凋亡率明显下降(10.33±0.66vs32.50±4.50,P<0.01)。5、荧光定量RT-PCR法比较2-△△Ct:只有在10ng/ml诱导3天后的PBMC加入HPAEC共培养的超抗原组,才可以见到AQP1的表达上调,AQP1的平均相对表达量增加4.87倍;Met-Rantes组与超抗原组相比,AQP1的表达下降(2.76±0.38 vs 4.87±0.60,P<0.01),差异有显著统计学意义。6、细胞免疫组化观测内皮P选择素和ICAM-1的表达:与对照组相比,上清组和超抗原组的ICAM-1表达均明显上调;镜下观察超抗原组的细胞染色比例与上清组相似,但超抗原组染色强度更加显著,高倍镜下多数细胞的膜周围有环状棕褐色染色圈形成,两组间比较,超抗原组的ICAM-1上调更加明显。P选择素在这两组的表达也是明显上调的,两组间比较,超抗原组的P选择素表达有增加趋势。与超抗原组相比较,加入T细胞趋化作用的拮抗剂的Met-Rantes组ICAM-1和P选择素的表达均受到抑制。结论1、SEB可以刺激体外培养的T细胞在早期出现增殖,由于增殖现象仅发生在TCR Vβ3、TCR Vβ17、TCRVβ14亚族,单独的MTS及TCRβ混合抗体的流式细胞仪方法均不能早期对这种特异增殖进行定量检测。2、SEB活化的T细胞除了典型的Th1细胞因子IFN-γ以外,Th2细胞因子IL-10及促进T细胞增殖的IL-2、前炎症因子TNF-α都是随SEB刺激浓度的增加和刺激时间的延长而增加释放的。3、T细胞趋化因子受体在SEB刺激后早期出现显著改变,CCR2显著下调,CCR5显著上调,提示可以将CCR5作为超抗原活化T细胞的早期标志。4、SEB活化的T细胞增加了对肺血管内皮细胞的趋化和粘附,这种趋化作用的增强与SEB活化的T细胞表面CCR5表达上调及HPAEC内皮细胞释放T细胞趋化因子MCP-1、MIP-1α、Rantes有关。5、SEB活化后的T细胞趋化粘附到肺血管内皮,内皮细胞脱落、凋亡增加;同时内皮AQP1、P选择素、ICAM-1的表达上调。T细胞粘附的直接作用较单纯的T细胞因子释放作用更加显著,提示超抗原活化的T细胞对血管内皮的直接效应。6、Met-Rantes可以拮抗SEB活化的T细胞对血管内皮的趋化作用,也可以抑制粘附的T细胞对内皮的致损效应,拮抗T细胞趋化作用可能为防治金黄色葡萄球菌sepsis提供新的策略。