宫颈癌是女性第二大常见的恶性肿瘤,是严重威胁全球妇女健康的重大疾病。高危人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)作为官颈癌的关键致病因子已得到公认,其中早期蛋白E6是最主要的癌蛋白。对E6功能的首次认识是通过对E6和P53相互作用的研究开始的,研究发现:E6蛋白的表达使E6结合P53和泛素蛋白连接酶E6-AP一起形成三聚体复合物,导致P53泛素化随后被26S蛋白酶降解,最终导致P53介导的正常细胞周期停顿功能丧失,宫颈上皮细胞发生恶性转化。宫颈癌细胞中P53的泛素化降解必须有E6AP的参与,E6AP属于泛素连接酶(ubiquitin ligase)家族,正常体内E6AP不与p53结合,而仅在表达HPV E6的情况下促成p53和E6AP结合,导致p53泛素化而降解。然而随着对E6功能的研究深入,发现E6降解P53并不能完全解释E6的致癌机制:有研究发现丧失p53结合区的E6蛋白突变体,虽然无法降解P53,但仍具有细胞异常转化功能;在HPV阳性的细胞中,也并不是总有p53降解的现象。随后有学者提出HPV E6癌蛋白也通过其他途径使细胞发生恶性转化。随着分子生物学技术的进步,又不断发现新的E6相关蛋白,比如E6BP,hDlg,Bak等,但很多机制尚不清楚。因此,从E6表达到宫颈癌发生其实是个复杂的调控网络,其中所涉及的基因表达调控和详细机理还有待进一步阐明。而目前对转录辅活化因子领域的研究使HPV 16 E6致细胞恶性转化的具体机理在基因调控层面有了更深入的研究。yADA3是酵母内的一种转录辅活化因子,人类的同源基因为hADA3。以往对酵母的研究发现yADA3作为核受体转录因子的关键辅活化因子,从而启动许多重要靶基因的转录激活途径。尽管目前对人类同源体hADA3蛋白的功能还不是很了解,但由于其氨基酸序列的高度保守,我们推测hADA3与yADA3类似,也可能作为一种辅活化因子参与许多重要分子的转录激活途径。有研究表明hADA3参与P53下游靶基因的转录激活及细胞周期停顿功能;也有研究发现hADA3参与雌激素受体介导的转录激活途径。P53和雌激素受体都是转录因子的重要成员,因此,hADA3蛋白是否极有可能也参与E6的致癌途径?而E6AP是否也参与宫颈癌细胞中hADA3蛋白的调节过程?本研究拟通过RNA干扰技术,分别干扰SiHa细胞中E6和E6AP表达,观察hADA3蛋白表达、细胞增殖和细胞凋亡情况,研究E6与hADA3蛋白,以及E6AP与hADA3蛋白的相互关系,以阐明hADA3作为E6新的靶蛋白在E6致癌过程中所起的作用。第一部分siRNA靶向HPV16 E6和E6AP的基因沉默目的:利用RNA干扰技术分别靶向HPV16 E6和E6AP基因沉默方法:设计若干对靶向HPV16 E6和E6AP的siRNA,体外转录合成,并将siRNA转染入宫颈癌细胞株SiHa中,分别观察E6和E6AP的mRNA表达情况,以筛殉龈扇判Ч罴训囊欢詓iRNA、浓度和时间。结果:E6-C siRNA使E6 mRNA表达下降,干扰浓度和时间分别为30uM和48小时,E6AP-B siRNA使E6AP mRNA表达下降,干扰浓度和时间分别为40uM和48小时。结论:1、体外转录合成的靶向HPV16 E6的siRNA可有效沉默病毒基因E6。2、体外转录合成的靶向E6AP的siRNA可有效沉默E6AP基因。第二部分HPV E6诱导E6AP参与的转录辅活化因子hADA3表达抑制目的:明确转录辅活化因子hADA3蛋白在HPV E6致癌途径中的作用;证实E6AP参与宫颈癌细胞中hADA3蛋白表达抑制的过程。方法:1、将筛选得到的E6-C siRNA转染入宫颈癌细胞株SiHa中,观察E6和hADA3的表达情况,以及细胞的生长、增殖和凋亡情况。2、将筛选得到的E6AP-B siRNA转染入宫颈癌细胞株SiHa中,观察E6AP和hADA3的表达情况,以及细胞的生长、增殖和凋亡情况。结果:1、E6-C siRNA干扰后,E6 mRNA和蛋白表达同步下降,hADA3蛋白表达增加,细胞生长和增殖受到抑制,细胞凋亡增加;2、E6AP-B siRNA干扰后,E6AP mRNA和蛋白表达同步下降,hADA3蛋白表达增加,细胞生长和增殖受到抑制,细胞凋亡增加。结论:1、HPV E6抑制转录辅活化因子hADA3蛋白的表达。2、E6AP参与宫颈癌细胞中hADA3蛋白表达抑制的过程。