铜离子是虾类重要的必需元素,它参与多种重要蛋白质和酶的组成,包括了酚氧化酶(PO)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)和血蓝蛋白。研究不同盐度下养殖的斑节对虾的生长和免疫的铜需求量,对研制合理的饲料营养配方,发展绿色环保、持续稳定发展的对虾养殖业具有重要的理论和实际意义。在饲料中添加不同浓度的铜离子(0、10、25、40、55和110mg/Kg饲料,实测含量分别为6.57、15.8、30.7、45.8、61.9和115.0mg/kg),分别在两个盐度下(5‰和20‰)喂养斑节对虾8周,取样检测对虾的生长情况(存活率、增重率、体色、肉色),体液免疫状态(血清PO活性,血清和肝胰腺总SOD活性、Cu-Zn SOD活性、总抗氧化活性、丙二醛含量、谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性),细胞免疫状态(血细胞总数、细胞凋亡率、活性氧含量、一氧化氮含量、酯酶活性)和酚氧化酶原系统相关基因(proPO1、proPO2、PE、βGBP、PPAF)的表达状况。对20‰盐度下养殖的斑节对虾进行了3个应激实验验证饲料铜离子的实际效果,包括水体亚硝酸盐应激、脂多糖注射和低氧耐受能力实验。研究结果如下:　　 1、研究饲料铜离子对对虾生长状况的影响。结果显示,在盐度为5‰时,饲料铜离子的添加量显著影响对虾的生长,增重率在铜添加量为40mg/kg时最高,对生长的最适添加范围是25-55mg/kg(基础含量约5-6mg/kg),最适含量为51.04mg/kg。110mg/kg组的存活率最低,但各组间差异不显著。当铜添加量<25mg/kg时会影响体表色素和足部蓝色色斑的形成。随着饲料铜浓度的升高,对虾肌肉的蓝颜色加深。在盐度为20‰时,饲料铜离子的添加量对增重率的影响不显著,最适添加添加范围是10-55mg/kg(基础含量约5-6mg/kg),最适含量为37.91mg/kg。110mg/kg组的存活率最低,显著低于25mg/kg组。铜添加量对不影响体表色素和足部蓝色色斑的形成。随着饲料铜浓度的升高,对虾肌肉的蓝颜色加深。结果表明在低盐度下斑节对虾的铜生长需求量较高。　　 2、研究饲料铜离子对对虾体液免疫功能的影响。结果显示,饲料铜添加量能显著影响血清PO、血清和肝胰腺Cu-Zn SOD活性,在5‰盐度下,根据血清PO、血清Cu-Zn SOD、肝胰腺Cu-Zn SOD活性的变化,得出最适铜含量分别为45.11、61.63和50.20mg/kg;在20‰盐度下,得出最适铜含量分别为58.24、56.55、38.34mg/kg。低盐度下斑节对虾的铜免疫需求量较高。铜的不足和过量都使这些酶的活力下降,导致总抗氧化能力(T-AOC)下降,肝胰腺丙二醛(MDA)含量上升,肝胰腺转氨酶活力下降,血清转氨酶活力上升。　　 3、以DCFH-DA为ROS特异探针,利用FCM检测虾类血细胞ROS含量的适宜的染料浓度和最佳的孵育时间分别为10μM和30 min。　　 4、以DAF-FM DA为NO特异探针,利用FCM检测虾类血细胞NO含量的适宜的染料浓度和最佳的孵育时间分别为10μM和60 min。　　 5、对斑节对虾的血细胞特性进行了研究。结果显示,根据FCM测得的细胞大小(FSC)和颗粒复杂度(SSC),可把斑节对虾血细胞分为三类:透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞,比例分别为9.98±4.23％、60.31±9.22％和23.32±6.96％。血细胞的自然凋亡率为5.09±1.66％。颗粒细胞含有最多的ROS、NO、溶酶体、线粒体以及酯酶活性最强。透明细胞的ROS、NO、溶酶体、线粒体最少。　　 6、研究饲料铜离子对对虾细胞免疫功能的影响。结果显示,在盐度为5‰时,110mg/kg组血细胞总数(THC)最低,ROS含量和凋亡率显著高于其他组,其它组之间差异不显著。在盐度为20‰时,110mg/kg组血细胞总数和酯酶活性最低,ROS含量和凋亡率显著高于其他组,其它组之间差异不显著。饲料铜添加量对NO含量没有影响。这些结果表明,铜的不足对血细胞的活性、ROS含量无显著影响,但铜的过量会诱导ROS过量产生,使细胞的凋亡率上升,从而使THC下降。　　 7、研究饲料铜离子对对虾酚氧化酶原系统相关基因表达的影响。结果显示,铜添加量为25-55mg/kg时,能显著提高血细胞proPO1、proPO2、PE和PPAF的表达,铜添加量对血细胞BGBP的表达没有显著影响。　　 8、对斑节对虾离体血细胞添加不同浓度的亚硝酸氮(0,0.1,0.5,1,5和10μM)进行应激,检测血细胞的活性和生理变化。结果显示,血细胞经亚硝酸氮刺激后,血细胞的ROS含量显著下降,可能是亚硝酸氮破坏了细胞膜上合成O2-的NADPH氧化酶；血细胞的NO含量下降,可能是亚硝酸氮抑制了一氧化氮合酶的活性；酯酶活性受到了亚硝酸氮的抑制；亚硝酸氮也诱导了细胞的凋亡。　　 9、在水体中添加不同浓度的亚硝酸氮(0,1,10,20mg/L)进行应激,检测血细胞的活性和生理变化。结果显示,水体亚硝酸氮应激导致了血细胞总数(THC)下降,ROS和NO含量上升,DNA损伤细胞和凋亡细胞比例上升。结果表明亚硝酸氮进入血淋巴中作用于血细胞,诱导细胞产生大量的ROS和NO,这些过量的ROS造成DNA损伤以及诱导细胞的凋亡,从而导致了THC的下降。ROS和NO通路的细胞凋亡造成了THC的下降是NO2-N的毒性机制之一。　　 10、对20‰盐度下不同铜含量饲料喂养8周的斑节对虾进行水体亚硝酸盐应激,检测THC、凋亡率和ROS含量。结果显示,饲料铜添加量为110mg/kg的对虾经NO2--N应激后,ROS含量最高,血细胞凋亡率最高,THC最低,表明过量添加的饲料铜离子反而更不利于对虾的抗亚硝酸盐应激能力。25-55mg/kg组的ROS含量显著低于对照组、10和110mg/kg组,表明当饲料添加铜含量在25-55mg/kg时能提高对虾的抗NO2--N应激能力。　　 11、对斑节对虾离体血细胞添加不同浓度(0,5和10μg/ml)的脂多糖(LPS)进行处理,检测血细胞的活性和生理变化。结果显示,经LPS处理后,大型细胞(颗粒细胞和半颗粒细胞)的比例逐渐下降,同时胞外的PO活性上升,表明血细胞经LPS刺激后进行胞吐作用脱颗粒释放酚氧化酶原系统。另一方面,LPS处理后,血细胞的ROS和NO含量不断上升,血细胞的凋亡率也不断上升,表明LPS刺激了血细胞产生过量的ROS和NO,从而对细胞造成损害,诱导了细胞的凋亡,这可能是LPS的毒性机制之一。　　 12、对斑节对虾进行不同浓度的LPS(0,2,8μg/g虾重)注射处理,检测血细胞的活性和生理变化。结果显示,经LPS注射后,对虾的THC下降,细胞凋亡率上升,ROS和NO含量上升,表明LPS诱导了过量的ROS和NO,导致细胞受到氧化伤害而发生凋亡,最终导致THC下降。另一方面,大型细胞的比例逐渐下降,血清PO活力上升,表明血细胞经LPS诱导后通过胞吐作用释放酚氧化酶原系统。对经过铜饲料喂养的斑节对虾进行LPS注射实验,结果显示当铜添加量为25.55mg/kg时,对虾经LPS注射后的存活率显著高于其它组,表明一定量的饲料铜离子确实能提高对虾抵抗LPS毒性的能力。　　 13、研究饲料铜离子对对虾氧合血蓝蛋白含量和低氧耐受能力的影响。结果显示,随着饲料铜含量的升高,氧合血蓝蛋白含量也逐渐升高,添加量>25mg/kg时氧合血蓝蛋白含量上升显著。对经过铜饲料喂养的斑节对虾进行低氧耐受能力实验,结果显示当饲料铜添加量>25mg/kg时可显著提高对虾的低氧耐受能力。　　 综合上述结果表明饲料中添加一定量的铜离子有利于提高斑节对虾的生长、免疫功能、抗亚硝酸盐毒性能力、抗脂多糖毒性能力和低氧耐受能力,过量的铜离子对对虾产生毒性,抑制对虾的免疫功能,不利于对虾抗亚硝酸盐毒性和抗脂多糖毒性。综合各指标,在5‰盐度下,斑节对虾的饲料铜适合添加范围为40-55mg/kg;在20‰盐度下饲料铜适合添加范围为25-55mg/kg。低盐度下的铜需求量更高。