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目的:高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析技术是一种利用DNA杂交与退火熔解特性进行核酸分析的技术,主要通过对DNA解离活动中荧光染料变化的监控,实现突变的筛查和检测。HRM分析技术不需要探针标记,并且能够在很大程度上减少测序的负担,具有特异性好、通量高、时间成本低、便于操作等优点。HRM分析技术还是一种同质闭管的检测方法,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与后续检测均在同一孔内完成,无需转移样品,能有效地减少交叉污染的可能性。近年来越来越多的专家学者尝试将HRM分析技术应用于法医学研究和相关案例中。本研究拟采用HRM分析方法,对微量或降解检材进行遗传标记分析,以期应用于法医学个体识别案件中。降解和低拷贝数(low-copy-number,LCN)的DNA样品是法医学相关案件中常见的检材,具有一定程度的挑战性,因为它们增加了样品处理的难度,并降低了从DNA获得遗传信息的可能性。HRM分析技术可用于遗传标记的基因分型,且在法医学领域已被尝试用于检测LCN和降解的DNA。但是,基于HRM技术对降解和LCN DNA检材中多个遗传标记的基因分型均尚未得到精确的评估和优化。为了探索HRM技术对LCN和降解DNA样本进行基因分型的能力,本研究选择三个遗传标记,并以LCN、人工降解DNA、以及法医学实际案例中常见的降解检材毛干DNA为模板进行基因分型,以期获得相关个体对应的遗传标记等信息,如ABO基因型和性别。本研究拟建立可应用于法医案件中的LCN和降解的DNA分析的HRM分析方法,并为后续应用HRM分析方法对短串联重复序列(short tandem repeat,STR)进行基因分型研究提供相关参考数据;研究也期待开发出用于更多DNA遗传标记基因分型的HRM分析策略,为最终用于法医学领域提供有价值的数据。研究方法:1、本研究选择ABO基因中6号外显子上的c.261delG和c.297A>G位点;7号外显子上的c.803G>C,c.1009A>G和c.1061delC位点;AMELY基因上的一处3bp插入位点为研究对象,针对这些位点设计短片段扩增特异性引物,用于HRM分析。2、用酚氯仿法提取全血DNA。3、使用PrepFiler~?Forensic DNA Extraction Kit(Thermo Fisher Scientific)试剂盒提取毛囊DNA。4、使用DNeasy~?Blood&Tissue Kit(QIAGEN)试剂盒消化结合PrepFiler~?Forensic DNA Extraction Kit(Thermo Fisher Scientific)的方式提取毛干DNA。5、使用DNase I DNA消化酶制备不同程度的人工降解检材。6、结合常规PCR扩增以及LightCycler~?480上53℃～65℃之间触底PCR的结果,选择退火温度,优化HRM条件。7、HRM数据使用LightCycler~?480基因扫描软件1.5版分析,经标准化和温度阈值调整后转换为图像;Cp值由软件LightCycler?480 Abs Quant/2nd Derivative Max Software生成。结果:1、应用HRM技术成功对c.261delG和c.297A>G两个位点的扩增产物进行了基因分型,并获得了样本的常见ABO基因型。2、应用HRM技术成功对双重PCR产物进行基因分型,同时检测ABO基因中的4个多态性位点(c.261delG,c.297A>G,c.1009A>G和c.1061delC),可实现对A/A,A/O01,A/O02,A201/O01,A205/O01,B/B,B/O01,B/O02,A/B,A201/B,A205/B,O01/O01,O02/O02,O01/O02十四个基因型的检测。3、在模板DNA低至100pg时,HRM分析仍能获得全部三个遗传标记的熔解曲线图,并能根据相应曲线获得准确且稳定的基因分型结果。4、当DNA片段长度超过60 bp时,HRM分析在三个遗传标记上均获得了稳定可靠的结果,DNA片段小于60 bp时,在所有样品中只能对c.261delG位点扩增产物进行稳定地基因分型。5、毛干DNA作为模板时,HRM分析技术可对AMELY上的3 bp GAT插入以及c.803G>C两个遗传标记进行准确分型,c.261delG位点则未能获得正确分型结果。结论:1、HRM分析方法是一种可靠且快速的基因分型方法,可用于ABO基因中c.261delG,c.297A>G,c.1009A>G和c.1061delC四个位点的检测。2、单一扩增产物HRM分析和双重扩增产物HRM分析均可用于上述四个位点的基因分型。3、HRM分析可用对低至100 pg或短至60 bp的DNA模板进行了基因分型,根据所选位点不同,可选择性地应用于毛干DNA样品中核基因组的检测。