随着蛋白类药物市场规模的不断扩大,高密度大规模培养模式已经成为哺乳动物细胞培养技术发展的必然趋势。在高密度培养过程中随之而来的CO2累积问题已经成为限制蛋白类药物高效工业化生产的关键性因素之一。由于培养环境中过高或过低的CO2分压(pCO2)不仅会对细胞生长、代谢、产物表达及产品质量产生不利影响,还会引起pH、渗透压等诸多过程环境参数的变化,在恶化培养环境的同时还会降低培养过程的稳定性及可控性。为此,前人已对CO2的危害及其在培养过程中的调控做了不少工作,但受困于研究手段的限制及代谢网络的复杂,这些工作多以宏观层面为主,主要通过过程控制手段调节pCO2,以减少pCO2改变对细胞及培养过程的影响。迄今为止,人们对CO2在微观层面上如何影响细胞代谢及产物加工过程却仍知之甚少,从而导致过程中CO2控制要求及控制后果不明确。因此想要落实合理的CO2控制策略,就必须理解高或低CO2对细胞行为的影响和作用机制,才能指导理性实验设计并实现稳定可控的大规模培养过程。为此,本文以GS-CHO细胞为研究对象,首先考察了培养环境的pCO2对细胞生长、代谢及产物表达的基本影响。随后,借助代谢通量分析和系统生物学手段,深入分析并验证过高和过低pCO2培养条件对细胞代谢的具体作用节点,并结合酶活检测等手段深入揭示pCO2调节细胞代谢的作用机制。最后在深入了解CO2对细胞代谢及培养过程影响的基础上,借助培养过程中pH控制、乳酸含量、补碱量与环境pCO2的定量关系,探讨如何采取合适的pH控制策略以避免培养环境中高低pCO2的出现,以实现高产、稳定且可控的哺乳动物细胞培养过程。本文首先采用前期建立的细胞流加培养工艺,考察了不同批次流加培养过程中的细胞生长、代谢和产物表达等工艺表现,发现细胞培养工艺未能在1500 L micro sparger组中重现。相较于其它培养过程,1500 L micro sparger组细胞密度、产物表达量均降低约40%,维持期细胞的乳酸代谢状态也未能由生成转为消耗。进一步分析发现,1500 Lmicro sparger组反应器CO2移除能力不足所导致的培养环境高pCO2可能是造成细胞生长和产物表达量下降以及代谢改变的主要原因。进一步考察培养环境pCO2对细胞生长、代谢和产物表达的基本影响,发现流加培养过程中培养环境的高pCO2不利于生长期及维持期细胞的生长、活性维持和产物表达。通过计算细胞的产物比生成速率可知,高pCO2条件下产物表达量下降的主要原因在于活细胞密度的下降。对比生长期及维持期细胞的葡萄糖和乳酸代谢,结果表明培养环境的高pCO2不利于细胞对葡萄糖的高效利用。同时,采用批培养实验考察低pCO2的影响,发现低pCO2(10mmHg)更会导致细胞无法生长,且大部分细胞消耗的葡萄糖转化为乳酸,细胞的葡萄糖有效利用率降低。在上述认识的基础上,针对培养环境中高pCO2(160 mmHg左右)对细胞生长和产物表达的不利影响,通过与正常pCO2条件对比分析维持期细胞胞内物质和能量代谢的差异,发现培养环境的高pCO2导致细胞物质及能量代谢整体处于低效状态,在维持期细胞的中心碳代谢过程中,胞内丙酮酸代谢及其下游TCA循环通路代谢发生较明显的改变。进一步采用转录组方法探究相关分子作用节点,发现高pCO2下细胞胞内LDHc转录水平的下调及IDH2转录水平的上调可能会影响胞内丙酮酸及α-酮戊二酸的含量,从而导致细胞丙酮酸代谢及TCA循环还原通量的下降及线粒体功能的减弱。通过在培养过程中添加丙酮酸及α-酮戊二酸,结果证明高pCO2条件减弱维持期细胞线粒体功能、降低细胞TCA循环通量的主要代谢调控节点在于胞内α-酮戊二酸的含量,当胞外添加α-酮戊二酸后可以促使细胞实现乳酸从生成到消耗的代谢状态转变,从而提高了细胞的有氧代谢效率,并增强细胞线粒体的功能,最终有效缓解了高pCO2对细胞生长和产物表达的不利影响。通过分析细胞胞内α-酮戊二酸的生成和消耗,发现培养环境的高pCO2对IDH3活性的产物反馈抑制效应会减弱线粒体内α-酮戊二酸的合成能力,加之高pCO2条件下细胞胞内IDH2转录水平的升高促使线粒体内更多的α-酮戊二酸消耗,两者可能是造成高pCO2条件下细胞胞内α-酮戊二酸含量不足的主要原因。反应器过度通气所导致的过低pCO2(10-20 mmHg)也不利于细胞培养工艺的表现,使得维持阶段细胞密度、细胞活性及产物比生成速率下降,最终大幅降低产物表达量。分析上述过程中CHO细胞胞外营养物消耗及代谢副产物生成,发现低pCO2培养条件不仅抑制了维持期细胞从乳酸生成向消耗的状态转变,而且还降低了细胞的氧化磷酸化水平,减小了细胞合成ATP的速率。进一步对比分析维持期细胞的胞内代谢通量分布,发现培养环境的低pCO2一方面明显提高了谷氨酸进入TCA循环的比例及流量;另一方面又阻碍了胞内乳酸和丙氨酸从生成到消耗的转变,使得细胞胞内由丙酮酸合成乙酰辅酶A的通量下降了约31%,进而显著减少了细胞胞内丙酮酸进入TCA循环途径的流量,导致细胞胞内TCA循环各途径的代谢通量及CO2净生成速率下降了约40-50%。为了探明低pCO2培养条件对细胞胞内代谢物含量的影响,非靶代谢组分析结果表明培养环境低pCO2对细胞代谢的影响主要体现在改变细胞中心碳代谢通路及增加细胞氧化压力两个方面。其中,在细胞中心碳代谢过程中低pCO2导致了胞内谷氨酸及TCA循环各中间代谢物含量的明显下降,而乳酸含量却明显升高,进一步的代谢物添加实验结果证明,低pCO2条件降低细胞TCA循环通量及有氧代谢效率的主要调控节点在于胞内丙酮酸含量。通过分析胞内丙酮酸的合成及消耗,发现低pCO2培养条件提高了维持期细胞胞内负责催化乳酸生成的LDHa转录水平,使得以丙酮酸为底物的LDH活性显著提高,从而阻止了乳酸从生成向消耗的转变,减少了胞内丙酮酸来源,这可能是导致胞内丙酮酸含量不足的主要原因。最后,本文通过建立培养液内pCO2、乳酸浓度和碱含量围绕pH的定量酸碱平衡关系:L+0.051 × pCO2 × 10(pH-6.38)=Bi+Bfed+Bbase,探讨了动物细胞大规模高密度培养过程中培养环境pCO2的控制策略。通过本文的研究,深入认识了培养环境中过高和过低的pCO2对细胞生长和产物表达的影响及其作用机制,研究结果可为细胞培养过程的放大和强化以及pCO2的合理控制提供科学指导。