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为进一步研究IKKε的癌基因作用是否对恶性胶质瘤细胞中Hippo信号通路具有调控功能,从而进一步扩展恶性胶质瘤中Hippo信号通路交叉网络以及发现新的下游促胶质瘤增殖和侵袭的因子和机制,研究通过应用免疫共沉淀技术(co-immunoprecipitation,co-IP)和蛋白质免疫印迹法(Western-blot,WB)结合的实验方法初步研究探索IKKε与Yes相关蛋白1(YAP1)外源性和内源性相互结合作用。经上述初步研究后继续初步探索IKKε对YAP1表达的影响以及对其在LATS2-YAP1磷酸化级联反应以及YAP1下游相关蛋白表达的影响,并在此基础上探索IKKε对胶质瘤细胞的侵袭和增殖能力的影响。方法第一部分:外源性IKKε和YAP1的相互作用研究:将重组质粒pCDNA3-IKKε-flag与HA-YAP1共转染至HEK293细胞中,后经过免疫印迹验证IKKε及YAP1在HEK293细胞中有效表达,并进一步使用anti-Flag抗体对HEK293细胞提取总蛋白后所得总蛋白进行免疫共沉淀(co-IP),同时应用SDS-PAGE胶进行沉淀物电泳,应用anti-Flag抗体验证沉淀物中是否富集IKKε蛋白,应用anti-HA抗体鉴定富集的蛋白复合物中是否存在YAP1蛋白。同法,反向进行以进一步验证anti-HA富集的蛋白复合物中是否存在IKKε蛋白。内源性相互作用研究:提取胶质瘤细胞系U87MG细胞总蛋白,并验证IKKε及YAP1的表达情况,应用anti-IKKε抗体对细胞总蛋白进行免疫沉淀,同时应用正常兔IgG对细胞总蛋白进行免疫沉淀,作为阴性对照;进而应用WB对免疫沉淀所得复合物进行验证,应用anti-YAP1鉴定anti-IKKε结合所得蛋白中是否存在YAP1蛋白。接着,同法进行反向验证,anti-YAP1对提取细胞总蛋白进行免疫沉淀,WB对免疫沉淀所得复合物进行验证,anti-IKKε鉴定anti-YAP1结合蛋白中是否存在IKKε蛋白。第二部分:我们应用慢病毒载体的IKKε-sh RNA体外转染U87胶质瘤细胞系,敲低IKKε表达后western-blot检测YAP1及P-YAP1(S127)、以及LATS2的表达变化,继之提取胞浆和胞核蛋白验证YAP1及P-YAP1(S127)在胞浆及胞核中的变化。以及提取总蛋白验证YAP1下游相关基因的表达变化,如c-myc、CTGF、cdk-6的变化。然后应用小干扰RNA技术敲低YAP1在胶质瘤细胞中的表达,并同样检测yap1下游相关蛋白表达变化。应用细胞周期实验、mtt细胞增殖实验、细胞克隆形成实验验证转染ikkε-shrna后的细胞周期、细胞增殖能力;应用划痕实验、transwell细胞侵袭实验验证转染ikkε-shrna后对胶质瘤细胞的迁移和侵袭力的影响情况。结果1.外源性验证:重组质粒pcdna3-ikkε-flag与ha-yap1共转染至hek293细胞后成功表达,且经免疫共沉淀方法双向验证证明ikkε结合蛋白中包含yap1蛋白;同时,yap1蛋白结合所得蛋白中包含ikkε。2.内源性验证:提取u87mg胶质瘤细胞总蛋白后,wb验证ikkε及yap1在u87胶质瘤细胞表达。anti-ikkε进行免疫沉淀,ib验证anti-ikkε结合的蛋白中包含yap1。反向ib验证anti-yap1结合蛋白中包含ikkε蛋白。3.第二部分抑制了ikkε表达之后,yap1蛋白的表达水平也同时降低,这也同时进一步验证了我们前一部分对二者相互作用的猜想,c-myc、ctgf、cdk-6等的表达水平也因之而降低;我们应用si-yap1抑制yap1蛋白表达,同时检测其下游的c-myc、ctgf、cdk-6,其变化趋势如前,其表达水平也降低,提示我们,也同时给予我们一个验证结论:ikkε能够参与hippo信号通路的调控,从而进一步参与调控恶性胶质瘤的生物学行为;胞浆、胞核蛋白分别验证yap1及p-yap1(s-127)在胞浆及胞核中水平的变化,得到敲低ikkε表达后胞浆中yap1蛋白水平降低,同时胞核中水平降低;而lats2蛋白水平升高,提取总蛋白中p-yap1(s127)水平升高,胞浆中p-yap1(s127)升高,胞核中也有同样表现,较未转染组水平升高。体外实验验证胶质瘤细胞u87的恶性细胞学行为的变化,如前实验结果所述,经过划痕实验、transwell侵袭实验,细胞的侵袭和转移能力被抑制;细胞周期变化检测,mtt细胞增殖检测以及细胞克隆形成实验等验证了经转染慢病毒处理后的胶质瘤细胞系的增殖能力受到抑制。结论1.ikkε与yap1存在直接或间接的相互作用关系,具体机制有待进一步研究,可能与其对hippo信号通路的调控功能有关。2.抑制ikkε表达,u87细胞的增殖和侵袭能力均有减弱,且抑制ikkε表达之后,yap1下游相关蛋白如c-myc、ctgf、cdk-6等的表达水平也因之而降低,此外,胞浆、胞核蛋白分别验证YAP1及p-YAP1(s-127)在胞浆及胞核中水平的变化,得到敲低IKKε表达后胞浆中YAP1蛋白水平降低,同时胞核中水平降低;而LATS2蛋白水平升高,这说明IKKε可以参与Hippo信号通路的磷酸化级联调控,进而对胶质瘤细胞系U87的增殖及侵袭能力进行调控。具体机制有待继续研究。