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苯被广泛应用于工业生产和日常生活,暴露极为普遍。长期以来职业性苯中毒事件屡有发生,近年来儿童白血病也在不断增加。因此,预防和控制苯的危害具有重要的公共卫生学意义。
苯的毒性效应与细胞凋亡(apoptosis)密切相关,异常凋亡是苯中毒表现的一个主要细胞学机制。如苯代谢产物引起血液先祖细胞的过度凋亡,导致造血功能抑制,表现为再生障碍性贫血。而苯诱导的突变细胞如果逃避了凋亡,则可能发展为多种血液系统的肿瘤。凋亡是多基因参与的复杂过程,目前苯介导的骨髓细胞凋亡的详细分子机制还不清楚,是否涉及凋亡相关基因的甲基化变异,尚未见报道。此外,以往对苯毒性的相关研究主要集中在血液系统,对雄(男)性生殖系统的损害作用重视不足,尽管已有少数高浓度苯暴露引起精子活力下降的毒理学报道,但低浓度苯暴露能否对精子活力产生影响还不清楚。
本研究以C57/BL6J雄性小鼠为受试对象,模拟职业人群的暴露方式,实施8h/天、5天/周、共13周的亚慢性苯动式吸入毒性实验。研究内容包括3部分:
1.亚慢性苯吸入染毒小鼠骨髓细胞周期和凋亡检测方法:
6-7周龄C57/BL6J雄性小鼠随机分成对照组、1ppm组、100ppm组3组,每组40只,采用动式染毒柜实施亚慢性吸入染毒。
处死小鼠,收集骨髓细胞,PI染色结合流式细胞仪检测骨髓细胞周期分布及凋亡状况。
结果:
各组G0+G1期细胞比例为:100 ppm组>对照组>1 ppm组(P<0.01);1 ppm组表现明显的S期细胞增多;100 ppm组G2/M期细胞急剧减少;苯暴露组细胞凋亡水平(Debris)明显大于对照组(P<0.01)。
结论:
苯暴露诱导了细胞凋亡并改变了细胞周期分布,ROS可能与苯介导细胞周期变化有关。
2.小鼠骨髓凋亡相关基因Survivin、Bcl2(l)13、Aif的表达和甲基化检测方法:
实时荧光定量PCR检测8个小鼠凋亡相关基因在骨髓细胞中的表达,通过初步结果筛选出有苯剂量效应的基因Survivin、Bcl2(l)13、Aif并加大样本验证。同时应用Sequenom MassARRAY(@)Methylation定量测定其启动子区CpG岛甲基化水平。
结果:
实时荧光定量PCR结果显示,在骨髓细胞中,苯暴露组相比对照组,Survivin、Bcl2113、Aif mRNA表达水平降低,100 ppm组中三个基因均呈显著降低(P<0.05),而且在1 ppm组中Survivin也明显降低(P<0.05)。
甲基化水平检测结果显示,总体上,基因Survivin启动子区CpG岛平均甲基化水平在三组中都较低且无明显组间差异(0 ppm组:2.9%±0.2%;1 ppm组:2.8%±0.6%;100 ppm组:3.1%±0.4%,n=10),其它两基因中也无明显改变,基因Bcl2(l)13(0 ppm组:4.2%±0.5%;1 ppm组:4.1%±0.1%;100ppm组:4.0%±0.5%,n=10),基因Aif(0 ppm组:3.5%±0.5%;1ppm组:3.5%±0.5%;100 ppm组:3.5%±0.4%,n=10)。苯暴露组中,三个基因均有两个CpG位点与对照组有统计学差异,所有这些位点甲基化水平都低于5%。
结论:
亚慢性苯暴露导致小鼠骨髓细胞凋亡相关基因(Survivin、Bcl2(l)13、Aif)mRNA表达下降涉及凋亡与周期依赖性,然而与其启动子区CpG岛甲基化水平关联较少。
3.小鼠精子活力检测方法:
处死小鼠,收集附睾精子,采用IVOS精子动力分析仪测定精子活力。
结果:
比较对照组,高剂量组小鼠体重和睾丸重量显著下降(P<0.05),睾丸脏器系数未见明显改变;低剂量组未显示体重、睾丸重量和睾丸脏器系数方面的有意义变化(P>0.05)。
与对照组比较,低剂量组小鼠精子直线运动速度(VSL)、前向性(STR)、直线性(LIN)和鞭打频率(BCF)均有统计学意义的降低(P<0.05);高剂量组精子密度、活动率、平均路径速度(VAP)、曲线运动速度(VCL)、VSL、LIN及STR均显著下降(P<0.05);且高剂量组精子活动率与低剂量组比较也显示有统计学意义的降低(P<0.05);精子头长比(Elongation)和侧摆幅度(ALH)在各组中均未见统计学差异。
结论:
说明即使是低浓度苯暴露(1 ppm)也能导致小鼠精子活力下降。