我国水禽养殖位居世界首位,每年有大量禽(如鹅)死于传染性疾病,尤其是具有高传染性、高致病性的新城疫病毒(New castle disease virus,NDV)。接种传统鸡用NDV疫苗不能有效预防鹅感染NDV。因此,应该寻找其它方法来抑制病毒感染。其中一种可行的方法是通过饲养来刺激提高鹅的免疫系统。近些年来,防御素(Avian beta-defensins,Av BDs)被认为是脊椎动物的重要天然免疫调节剂。本实验设计特异性引物,利用RT-PCR方法从鹅体内扩增出四个新的鹅β-防御素:Av BD4、Av BD7、Av BD12、Av BD16,i NOS,7个Toll样受体(TLR):TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15和8个细胞因子:白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-18(IL-18)、γ干扰素(IFN-γ)、主要组织相容性复合体(MHC class I)、FAS配体(FASLG)。其中鹅Av BD4包含171个碱基,编码56个氨基酸;鹅Av BD7、Av BD12、Av BD16分别由201个、198个、180个碱基组成,分别编码66个、65个、59个氨基酸。经同源性分析,鹅Av BD4与鸡Av BD4同源性最高为80.9%;鹅Av BD7与鸭、鸡Av BD7同源性最高为84.4%;鹅Av BD12与鸡Av BD12同源性为87.4%;鹅Av BD16与鸭Av BD16同源性最高为66.3%。此外分析鹅TLRs、i NOS及细胞因子序列,结果显示鹅TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15与鹅TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15同源性分别为:99%、100%、100%、100%、100%、100%;鹅IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ、MHC class I、FASLG与鹅IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ、MHC class I同源性为100%、100%、100%、100%、100%、100%、93%。而鹅TLR1、iNOS、FASLG与鸡TLR1、i NOS、FASLG同源性为98%、90%、89%,所以将其命名为鹅TLR1、i NOS、FASLG。为研究新鹅β-防御素的生物学活性,采用His标签蛋白原核表达系统,将四个基因分别亚克隆到pPro EX HTa上,构建4个重组表达质粒。将重组表达质粒转化到大肠杆菌Rosseta感受态中,用IPTG进行诱导,诱导后经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,诱导表达的蛋白大部分都以包涵体形式存在。重组蛋白抗菌活性测定结果表明,四种重组蛋白对这五种菌均具有抗菌活性,且随蛋白浓度的增加抑菌活性增强。此外,高浓度盐离子抑制重组蛋白的抗菌活性。重组蛋白对鸡红细胞没有溶血活性。为探讨鹅β-防御素体内抗NDV感染的作用机制,本实验将20只40日龄的健康鹅,随机分为两组,其中对照组10只,攻毒组10只。攻毒组通过点眼、滴鼻的方式以每只鹅100 ul稀释后的Go/CH/LHLJ/1/06NDV接种。对照组10只,不攻毒。攻毒组与对照组分别在攻毒后的36 h、72 h各取5只鹅颈部放血致死,采取呼吸、消化、免疫系统的气管、肝脏、腺胃、肺脏、盲肠扁桃体、肾脏、脾脏、法氏囊、哈德氏腺、脑10个组织,采用实时荧光定量RT-PCR法,从感染Go/CH/LHLJ/1/06病毒后36 h和72 h后的鹅10个组织中检测Go/CH/LHLJ/1/06病毒含量、鹅β-防御素、iNOS、TLRs和细胞因子基因的含量,并且分析组织中病毒载量与鹅β-防御素的相关性。结果表明,对照组未检测到Go/CH/LHLJ/1/06病毒,而攻毒后可在肺脏、肾脏、肝脏、腺胃、脾脏、盲肠扁桃体、法氏囊中检测到Go/CH/LHLJ/1/06病毒,且攻毒后36 h和72 h在脾脏和肝脏中差异显著。对脾脏组织中病毒含量和鹅β-防御素相关性分析,结果显示,攻毒后36 h只有AvBD1、Av BD5、Av BD10、Av BD12、Av BD16与病毒载量呈现相关性,且只是Av BD12差异显著(P<0.05);攻毒后72 h Av BDs均呈现相关性,且Av BD4、Av BD5、Av BD6、Av BD9、Av BD10、Av BD12相关性差异显著(P<0.05或P<0.01)。对目的基因检测结果显示,除了鹅Av BD3基因未检测出来和TLR4分布局限以外,其余基因在组织中分布广泛,其中鹅Av BD2、Av BD5、Av BD7、Av BD9和Av BD12在对照组和攻毒组36 h和72 h的检测的是10个组织中均检出,且表达差异不显著(P>0.05);鹅Av BD1、Av BD6、Av BD10基因不是在所有组织中都能检测到,并且表达差异不显著(P>0.05);而鹅攻毒后72h鹅Av BD4基因在的脑、气管和脾脏中表达量显著下调(P<0.05),鹅攻毒后36 h鹅Av BD16基因在的盲肠扁桃体和哈德氏腺组织中表达显著上调(P<0.05),在攻毒后72 h的脑组织中显著下调(P<0.05)。其中,鹅攻毒36 h后鹅TLR1基因在肺脏、盲肠扁桃体及哈德氏表达量上调,在肝脏表达量下调,且差异显著(P<0.05),在攻毒后72 h鹅TLR1在肝脏、盲肠扁桃体及法氏囊表达量上调且差异显著(P<0.05);鹅攻毒后72 h鹅TLR2基因在盲肠扁桃体表达量显著上调(P<0.05);鹅攻毒后72 h鹅TLR7基因在脾脏中显著上调(P<0.05)。鹅攻毒后与对照组相比鹅TLR3、TLR4、TLR5和TLR15基因表达量变化不显著(P>0.05)。此外,鹅攻毒后72 h鹅i NOS在脾脏中表达量显著上调(P<0.05),鹅攻毒后72 h鹅IFN-γ在法氏囊表达量显著上调(P<0.05),鹅攻毒后72 h鹅IL-8在盲肠扁桃体显著上调(P<0.05),鹅攻毒后36 h鹅MHC class I在哈德氏腺显著上调(P<0.05)。根据以上结果,选择Av BD4和Av BD16用于体外抗NDV研究。结果表明,重组鹅Av BD4和Av BD16蛋白体外抑制NDV(Go/CH/LHLJ/1/06株)病毒复制作用不显著。综上所述,本实验从鹅体内分离出四个新的鹅β-防御素,其重组蛋白具有广谱抗菌作用且受高浓度盐离子影响,此外不具有溶血活性。此外,本实验还从鹅体内克隆出i NOS、TLRs和细胞因子。经Go/CH/LHLJ/1/06病毒诱导后,鹅Av BD4和AvBD16基因的表达量显著变化。TLR1、TLR2、TLR7、IL-2、IL-8、IFN-γ表达量均显著变化。重组鹅Av BD4、Av BD16蛋白对抑制Go/CH/LHLJ/1/06病毒复制不显著。