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伏马菌素（Fumonisin,FB）主要由串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）、层生镰刀菌（Fusarium proliferatum）等镰刀菌属产生的次级代谢产物,主要污染玉米及其制品。目前,已发现20多种伏马菌素及其衍生物,其中FB1是最主要组分,其毒性也最强。检测样品中FB1的方法有理化分析法和免疫分析法,免疫分析法具有选择性好、操作简便、耗时短、成本低等优点,适合于食品安全监测时高通量快速筛检。而FB1是小分子化合物,一般采用竞争免疫分析模式进行检测;这种检测模式需要FB1标准物和化学合成抗原,化学合成抗原时也需使用大量FB1标准物及有机溶剂;这些物质的使用对操作人员的健康具有潜在的危害,若废液处理不当,还可能对实验室及环境造成污染。本研究以anti-FB1 m Ab（3F11）为靶分子,从羊驼天然纳米抗体噬菌体文库中淘选得到与anti-FB1 m Ab（3F11）特异结合的抗独特型纳米抗体,以该抗独特型纳米抗体作为FB1抗原模拟物,替代传统抗原,建立免疫分析方法提高检测灵敏度。其次,将抗独特型纳米抗体与碱性磷酸酶融合表达,将融合蛋白作为酶标抗原,分别建立了一步酶联免疫分析和一步化学发光免疫分析方法。最后,通过热点随机突变使抗独特型纳米抗体亲和力得以提高,并将亲和力提高的Ab2Nb B1D作为标准物,建立了FB1绿色免疫分析方法。主要研究内容如下:1从羊驼天然纳米抗体噬菌体文库中首次淘选得到抗FB1单抗的抗独特型纳米抗体,建立以抗独特型纳米抗体替代传统抗原的绿色免疫分析方法。1.1基于抗独特型纳米抗体FB1模拟物的淘选以anti-FB1 m Ab（3F11）为靶分子,经过3轮亲和淘选,从羊驼天然纳米抗体噬菌体文库中获得一株可与anti-FB1 m Ab（3F11）特异性结合的抗独特型纳米抗体B26,建立了检测FB1的间接竞争Phage-ELISA,该方法的IC50值为1.07±0.22 ng/m L。1.2抗独特型纳米抗体的表达及其在免疫检测中的应用将B26的编码基因克隆至pET-25b表达载体,构建原核表达载体pET-B26,自诱导表达纯化后得到可溶性的抗独特型纳米抗体,将其作为包被抗原建立Nb-ELISA;该方法的IC50为0.95±0.12 ng/m L,线性范围为0.27–5.92 ng/m L;灵敏度比传统ELISA提高了20倍;与FB2的交叉反应率为4.93%,与其它四种真菌毒素（DON、AFB1、OTA、ZEN）无交叉反应;Ab2 Nb只选择与anti-FB1 m Ab（3F11）可变区发生特异性结合,其为半抗原抑制性独特型抗体;对样品进行加标回收试验,回收率为71.90%-112.15%之间;分别采用Nb-ELISA与市售ELISA试剂盒对30份实际样品进行检测,两种方法检测结果的相关性为0.992。1.3抗原抗体结合动力学参数的分析采用生物薄膜光干涉技术分别对Ab2 Nb、FB1-BSA与anti-FB1 m Ab（3F11）的结合动力学参数进行测定;Ab2 Nb对anti-FB1 m Ab（3F11）的KD值为164.6n M,FB1-BSA对anti-FB1 m Ab（3F11）的KD值为0.62 n M。Ab2 Nb与anti-FB1m Ab（3F11）具有较低的亲和力,Nb-ELISA显示出比传统ELISA更高的灵敏度。结果提示:在竞争免疫分析方法中,小分子化合物与包被抗原竞争能力起关键作用,适当选用与抗体的亲和力较低的包被抗原,有利提高检测灵敏度。2成功将抗独特型纳米抗体与碱性磷酸酶融合表达,首次制备了纳米抗体类酶标抗原,建立检测FB1的直接竞争一步法绿色免疫分析方法。2.1直接竞争一步ELISA的建立成功制备了抗独特型纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白（Ab2 Nb-AP）,该融合蛋白仍保留了良好的碱性磷酸酶活性和抗体结合能力;以Ab2 Nb-AP为酶标抗原,建立了检测谷物中FB1的直接竞争一步ELISA;该方法的IC50为2.69±0.25ng/m L,线性范围为0.93–7.73 ng/m L,最低检测限（LOD）为0.35 ng/m L;批内加标回收率为81.50%-112.24%、批内变异系数为2.43%-11.41%,批间加标回收率为71.20%-114.03%、批间变异系数为2.51%-12.50%。2.2直接竞争一步CLIA的建立以Ab2 Nb-AP为酶标抗原,建立了检测谷物中FB1的直接竞争一步CLIA;该方法的IC50为0.89±0.09 ng/m L,线性范围分别为0.29–2.68 ng/m L,LOD为0.12 ng/m L,灵敏度比以FB1-BSA建立的两步法ELISA提高了9倍;与FB2的交叉反应率为4.93%,与其它四种真菌毒素（DON、AFB1、OTA、ZEN）无交叉反应;批内加标回收率为85.40%-112.68%、批内变异系数为2.47%-13.03%,批间加标回收率为83.50%-109.25%、批间变异系数为2.74%-14.86%;实际谷物样本的检测结果与LC-MS/MS的检测结果相关系数为0.97。3抗独特型纳米抗体体外亲和力成熟3.1热点随机突变提高抗独特型纳米抗体亲和力对B26的CDR3区2处热点涉及4位氨基酸进行随机突变,通过亲和淘选获得4株突变子;相比B26,4株突变子的显色值明显增强,提示其与anti-FB1m Ab（3F11）的结合活性增强,灵敏度均降低;B1D、B2E、B3I和B4L与anti-FB1m Ab（3F11）的KD值分别为10.4 n M、25 n M、49.5 n M和55 n M,提示4株突变子的亲和力均得到提高,其中B1D与抗体的亲和力较B26提高15.8倍,进一步证实:在竞争免疫分析方法中,检测抗原与抗体的亲和力提高了,其检测灵敏度将低;相比B26和化学合成抗原,B1D、B2E、B3I和B4L的热稳定性均有明显提高。3.2基于抗独特型纳米抗体的绿色ELISA方法的建立。分别建立以FB1标准物及Ab2 Nb B1D为标准物的间接竞争ELISA;在相同的抑制率下,Ab2 Nb B1D浓度与FB1标准物浓度具有良好的线性相关,方程为y=1.7x+3.2（R2=0.998）,其中y为FB1浓度,x为Ab2 Nb B1D浓度;采用两步法计算FB1含量,首先根据样品检测的抑制率计算替代标准物的Ab2 Nb B1D浓度,然后通过Ab2 Nb B1D浓度与FB1的线性相关方程,再转换为样品中FB1含量。进行FB1的添加回收试验,批内加标回收率为75.60%-112.12%、批内变异系数为2.70%-9.66%,批间加标回收率为72.80%-115.44%、批间变异系数为3.17%-11.04%;分别采用以Ab2 Nb B1D为标准物的间接竞争ELISA和LC-MS/MS用于实际玉米样本中FB1含量的测定,并将其结果进行相关性分析,相关系数为0.986。