降解养殖水体亚硝酸盐的微生物制剂研究

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我国是个渔业大国,近年来淡水养殖规模日益扩大,集约化、高密度养殖已成为当前水产养殖业的主流模式。而随之出现的养殖水体水质恶化、水产养殖动物疾病多发的问题制约了养殖经济效益的进一步提高,其中亚硝酸盐含量超标的问题尤为突出。亚硝酸盐是氨在转化为硝酸盐过程中的中间产物,含量超标会对鱼体产生毒害作用,严重的会使养殖动物大量死亡,对水产养殖业造成极大的危害。因此它的含量是评价养殖水体水质的最要指标之一。   本论文通过对NO2-降解菌株的筛选、菌株培养条件的优化、复合微生物制剂的制备以及养殖水体环境对NO2-降解率的影响等方面进行了研究,初步探索了该复合微生物制剂应用于降解养殖水体NO2-的可行性。主要研究结果如下:   1.从虾塘淤泥中分离出一株光合细菌,初步鉴定为球形红假单胞菌。   2.分别对分离得到的光合细菌Ⅰ以及实验室保藏菌株植物乳杆菌、短乳杆菌、热带假丝酵母进行了降解液体培养基中NO2-的试验研究。结果表明,该四株菌株对液体培养基中的NO2-均有很好的降解效果。在接种后第2d,光合细菌Ⅰ、植物乳杆菌、短乳杆菌、热带假丝酵母的NO2-降解率分别为47.06%、98.1%、95.62%、95.51%;在培养的10d内NO2-的最高降解率分别为99.96%、99.96%、99.94%、99.97%。   3.对选取的四株菌株进行降解养殖水样NO2-的试验研究。研究结果表明,光合细菌Ⅰ、植物乳杆菌、短乳杆菌、热带假丝酵母在培养过程中对养殖水样中NO2-的最高降解率分别为85.87%、92.19%、81.25%、92.52%。其中,短乳杆菌在培养的第12d有大幅度的反弹现象:光合细菌Ⅰ、植物乳杆菌、热带假丝酵母在被测的10d内效果比较稳定。因此,选定光合细菌Ⅰ、植物乳杆菌、热带假丝酵母为试验菌株,制备降解养殖水体NO2-的复合微生物制剂。   4.对试验菌株的培养条件进行了优化。采用正交试验得到植物乳杆菌高密度培养的最佳培养条件:总糖度7%的麦芽汁、2%水解植物蛋白粉、发酵温度35℃、pH8、接种量7%,在此条件下培养21h,培养液中的活菌数可以达到2.9×109cfu/mL;通过均匀设计试验得到热带假丝酵母的最佳培养条件:总糖度4%的麦芽汁、pH5、温度26℃、装液量25mL、接种量2%、转速100rpm,在此条件下培养36h,培养液OD560值达到2.79;采用响应面分析设计方法对光合细菌Ⅰ的培养条件进行优化,优化后的光合细菌Ⅰ培养条件为:NH4C10.99g、NaHCO31.68g、酵母膏0.6g、乙酸钠2.5g、K2HPO40.4g、FeSO40.005g、MgCl20.4g、NaC12g、温度30℃、pH8、接种量8.9%、光照3500Lx、蒸馏水1000mL,在此条件下培养5d,培养液OD660可从0.972提高到1.343。   5.采用正交试验确定了复合微生物制剂中菌株间的最佳配比。试验结果表明,复合微生物制剂降解NO2-的最优配比为光合细菌Ⅰ:植物乳杆菌:热带假丝酵母=1:2:1(v/v/v),以此配比组合的微生物制剂对养殖水样NO2-的降解率为97.5%。   6.分别在25℃和4℃两种条件下贮藏,按0.5%的接种量接种,对该复合微生物制剂的贮藏活性进行了研究。研究结果表明,25℃条件下贮藏的发酵液存放30d时,接种培养48hN02-的降解率可达93.5%,基本没有降低,而存放60d时,接种培养48h NO2-的降解率仅为8.63%,其原因是微生物死亡率较高;而4℃贮藏的发酵液在存放90d时,接种培养48h NO2-的降解率仍可高达98.27%,说明低温贮藏条件下,复合微生物制剂降解NO2-的性能保持良好。因此,该复合微生物制剂4℃条件下贮藏期至少为90d,25℃条件下贮藏期为30d。   7.探讨了复合微生物制剂的生物量与降解NO2-能力的关系,结果表明在养殖水样中菌体生长与降解NO2-作用是同步关系。此外,对复合微生物制剂降解养殖水体NO2-的特性进行了研究表明,养殖水体生态因子如初始NO2-浓度、pH值、温度、溶氧以及接种量对微生物制剂降解NO2-都有影响。其中,初始NO2-浓度对复合微生物制剂降解NO2-的能力影响显著,当NO2-浓度在5mg/L以下时,其NO2-降解率均在95%以上,当NO2-浓度高于5mg/L时,对NO2-的降解率下降;pH的影响作用最小;较适合的培养条件为温度35℃、接种量0.5%、静置培养。复合微生物制剂在此条件下培养24h,NO2-降解率可达99.31%。   8.对复合微生物制剂降解NO2-的机制进行了初步探索。在NO2-被降解完全时,培养液中检测不到氨态氮和硝酸盐的产生,用顶空固相微萃取方法抽取密封瓶培养液上空气体,用GC/MS对气体的组成进行检测,推测NO2-的降解途径为NO2--N→N2。
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