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SipB编码鼠伤寒沙门菌的一种侵袭性蛋白，其与细菌细胞膜耐高渗能力有关，能够调节肠道的炎症反应，但是有关对其毒力、免疫功能等生物学特性方面的报道较少; CRP是编码cAMP的受体蛋白，目前已证实其与细菌的新陈代谢、碳源的利用等有关，是沙门菌主要的毒力蛋白，但是对于其是否诱导巨噬细胞的死亡以及影响细胞糖酵解方面未见报道。因此本实验通过重组自杀性质粒pREΔsipB介导的细菌同源重组技术在鼠伤寒沙门菌SL1344和SL1344Δcrp的基础上构建出 SL1344ΔsipB和 SL1344ΔcrpΔsipB缺失株，并对它们生物学特性以及诱导巨噬细胞的死亡和糖酵解等方面进行比较，以了解 sipB的基本功能，探讨 sipB和 crp基因诱导巨噬细胞死亡与糖酵解的关系，为进一步研究减毒沙门菌诱导巨噬细胞死亡的糖酵解机制奠定良好基础。主要内容如下： 1. SL1344ΔsipB、ΔcrpΔsipB缺失株的构建与鉴定 以鼠伤寒沙门菌 SL1344为模板，扩增出 sipB基因的上下游片段 sipB1和sipB2，分别将 sipB1和 sipB2亚克隆到中间载体 pBluescriptSK(+)，再将上下游的融合片段克隆到自杀性质粒 pRE112中，构建出重组自杀性质粒pRE112ΔsipB。最后以携带重组自杀性质粒的大肠杆菌χ7213（pRE112ΔsipB）为供体菌，分别以鼠伤寒沙门菌 SL1344和 SL1344Δcrp为受体菌进行混合培养，通过两步法筛选出SL1344ΔsipB和SL1344ΔcrpΔsipB缺失菌株。 2. SL1344ΔsipB、ΔcrpΔsipB缺失株的生物学特性检测 通过对缺失菌株和亲本菌株进行生化特性、生长曲线、遗传稳定性、运动性、生物被膜形成能力、体内外的侵袭能力以及对小鼠毒力等方面进行检测。结果表明：SL1344ΔsipB缺失株在生化特性、生长特性、运动性以及生物被膜形成等方面与亲本菌株一致；SL1344ΔcrpΔsipB双缺失株的生化特性与 SL1344Δcrp仍保持一致，与亲本菌株相比其生化特性发生了变化，生长速度发生了减慢，运动性和生物被膜形成能力均发生了降低；小鼠毒力以及体内外的侵袭能力等方面缺失株和亲本株相比均发生了显著的降低（P<0.05）；但是均能够不同程度的刺激机体产生体液免疫应答，ΔsipB、ΔcrpΔsipB、Δcrp三株缺失株免疫后对100LD50亲本菌株的攻毒分别能提供50％、60%和90%左右的免疫保护效力。以上结果表明 sipB是沙门菌的一个免疫原性基因，而 crp有潜力作为疫苗缺失菌株的候选基因。 3. SL1344ΔsipB、ΔcrpΔsipB缺失株引起巨噬细胞死亡的检测 将不同沙门菌感染巨噬细胞 RAW264.7后分别应用流式细胞术和 ELISA方法对细胞死亡情况和Caspase-1,3,8,9的酶活性进行检测。结果显示：亲本菌株感染细胞死亡率显著高于缺失组（P<0.05）；Caspase-1、Caspase-8和 Caspase-9的活性在感染后各个时间点缺失株组均低于亲本株组（P<0.05），而 Caspase-3在感染4 h后缺失株组均低于亲本株组（P<0.05）。表明不同沙门菌诱导巨噬细胞死亡的能力不同，均是通过先激活Caspase-1,8,9再激活Caspase-3的途径诱导巨噬细胞死亡。 4. SL1344ΔsipB、ΔcrpΔsipB缺失株感染巨噬细胞糖酵解的检测 将不同沙门菌感染巨噬细胞后不同时间点的细胞进行丙酮酸、乳酸、ATP含量以及已糖激酶（HK）活性的检测。结果表明：不同时间点的细菌感染组和空白对照组细胞内丙酮酸含量差异不显著（P>0.05）;乳酸、ATP含量以及 HK活性结果显示：各细菌感染组在4 h以后均显著高于空白对照组（P<0.05），而亲本菌株感染组均显著高于各缺失株组（P<0.05）。表明不同沙门菌感染巨噬细胞对其糖酵解的影响能力不同。