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目的:脑胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤之一。化疗是其重要的治疗手段。但由于血肿瘤屏障（blood-tumor barrier,BTB）的存在,严重限制了药物到达肿瘤组织,影响了化疗效果。BTB由脑肿瘤细胞、胶质瘤微血管内皮细胞（glioma-exposed endothelial cells,GECs）、星形胶质细胞和周细胞构成,具有部分血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）的特性。选择性的开放BTB,进而增加肿瘤组织中的药物浓度,对于提高胶质瘤的化疗效果至关重要。非编码RNA（noncoding RNA,nc RNA）主要包含短链nc RNA和长链nc RNA（long nc RNA,lnc RNA）等。转录的假基因被划分为lnc RNA中的一类。假基因在多种恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用。假基因RPL32P3（ribosomal protein L32pseudogene 3）定位于人染色体3q21.3,其亲本基因为RPL32。目前RPL32P3在GECs中的表达和功能尚未被研究。KMT2A（lysine methyltransferase 2A）,又称MLL1（mixed lineage leukemia 1）,编码一个含有包括SET结构域在内的多种结构域的大分子量蛋白,具有组蛋白第三亚基四号赖氨酸（histone 3 lysine 4,H3K4）甲基转移酶的作用。KMT2A与多种人类恶性肿瘤有关。然而,关于KMT2A在GECs中的表达和功能的研究尚未见报道。H3K4me3指的是组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化,三甲基团由组蛋白赖氨酸甲基转移酶转移。在表观遗传学研究中,H3K4me3被当作组蛋白密码或组蛋白标记来识别基因启动子。H3K4me3通常在基因转录起始点高度富集,并激活基因转录。H3K4me3已被报道在多种肿瘤的生物过程中发挥作用。YBX2（Y-box binding protein 2）属于Y-box结合蛋白,参与DNA修复、转录和翻译等各种过程。YBX2被报道具有稳定mRNA的作用。YBX2目前已被证实在多种肿瘤中起促癌作用。其在GECs中的表达情况和功能尚未见报道。HNF4G（hepatocyte nuclear factor 4 gamma）是HNF4（hepatocyte nuclear factor 4）的同工型之一,属于孤儿核受体超家族,是调节基因表达的转录因子。HNF4G在多种恶性肿瘤中发挥致癌作用。然而,HNF4G在GECs中的表达和功能尚不清楚。本研究首先研究RPL32P3、KMT2A、YBX2和HNF4G在GECs中的内源性表达,进一步明确上述分子间的作用模式,以及对BTB通透性的调节作用与机制。本研究旨在揭示调节BTB通透性的新机制,为脑胶质瘤的化疗等综合治疗提供新思路。研究方法:1.培养人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3细胞、人脑正常星形胶质细胞系NHA细胞、人脑星形胶质母细胞瘤细胞系U251细胞和人胚肾细胞系HEK293T细胞。2.构建体外BBB模型和体外BTB模型。3.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验检测RPL32P3、RPL32、KMT2A、YBX2和HNF4G的表达。4.Western blot实验检测KMT2A、YBX2和HNF4G的表达。5.分别构建稳定敲减和过表达RPL32P3、KMT2A、YBX2和HNF4G的体外BTB模型。6.荧光原位杂交（FISH）实验检测RPL32P3的表达和定位。7.免疫荧光实验检测YBX2和HNF4G的表达和定位。8.跨内皮电阻值（TEER）实验和辣根过氧化物酶（HRP）实验检测BTB的完整性和通透性。9.Western blot实验检测紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达。10.免疫荧光实验检测ZO-1、occludin和claudin-5的表达和分布。11.RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验检测RPL32P3与KMT2A、HNF4G mRNA与YBX2的结合作用。12.染色质免疫沉淀（ChIP）实验检测KMT2A与YBX2启动子区、HNF4G与ZO-1、occludin和claudin-5启动子区的结合作用。13.双荧光素酶报告基因实验检测KMT2A与YBX2启动子区、HNF4G与ZO-1、occludin和claudin-5启动子区的结合作用。14.RNA纯化后的染色质分离（Ch IRP）实验检测RPL32P3与YBX2启动子区的结合作用。15.新生RNA捕获实验和RNA半衰期实验检测HNF4G mRNA的稳定性。16.凋亡实验检测BTB模型U251细胞的凋亡率。结果:1.RPL32P3在GECs中高表达,敲减RPL32P3降低了BTB的TEER值,提高了HRP渗透量,减少了紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达,并降低了ZO-1、occludin和claudin-5在细胞膜上分布的连续性;过表达RPL32P3提高了TEER值,降低了HRP渗透量,增加了ZO-1、occludin和claudin-5的表达,并提高了其在细胞膜上分布的连续性。2.YBX2在GECs中高表达,敲减YBX2降低了BTB的TEER值,提高了HRP渗透量,减少了ZO-1、occludin和claudin-5的表达,并降低了其在细胞膜上分布的连续性;过表达YBX2提高了TEER值,降低了HRP渗透量,增加了ZO-1、occludin和claudin-5的表达,并提高了其在细胞膜上分布的连续性。3.RPL32P3与KMT2A结合促进了YBX2启动子区H3K4me3修饰,敲减RPL32P3削弱了这种修饰。4.RPL32P3与YBX2的启动子序列生理性结合。5.与单独敲减RPL32P3相比,敲减RPL32P3与敲减YBX2联合进一步降低了BTB的TEER值、增加了HRP渗透量,并进一步减少了ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表达;而过表达YBX2则可以逆转敲减RPL32P3产生的TEER值、HRP渗透量及紧密连接相关蛋白表达的变化。6.HNF4G在GECs中高表达,敲减HNF4G降低了BTB的TEER值,提高了HRP渗透量,减少了ZO-1、occludin和claudin-5的表达,并降低了其在细胞膜上分布的连续性;过表达HNF4G提高了TEER值,降低了HRP渗透量,增加了ZO-1、occludin和claudin-5的表达,并提高了其在细胞膜上分布的连续性。7.YBX2靶向结合并增加HNF4G mRNA的稳定性。8.和单独敲减YBX2相比,敲减YBX2与敲减HNF4G联合进一步降低了BTB的TEER值、增加了HRP渗透量,并进一步减少了ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表达;而过表达HNF4G则可以逆转敲减YBX2产生的TEER值、HRP渗透量及紧密连接相关蛋白表达的变化。9.HNF4G与ZO-1、occludin和claudin-5的启动子直接结合并促进其转录,调节BTB通透性。10.敲减RPL32P3、YBX2和HNF4G的单独和联合应用促进阿霉素诱导的胶质瘤细胞凋亡。结论:1.假基因RPL32P3在GECs中高表达,通过结合组蛋白甲基转移酶KMT2A并将其募集至YBX2启动子区,介导YBX2的H3K4me3,从而促进YBX2转录。2.高表达的YBX2结合并促进HNF4G mRNA的稳定性。3.高表达的HNF4G通过与紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的启动子直接结合,促进其转录活性,调节BTB的通透性。4.RPL32P3、YBX2和HNF4G的同时敲减与阿霉素的联合治疗可促进胶质瘤细胞凋亡。5.假基因RPL32P3通过YBX2/HNF4G途径在调节血肿瘤屏障通透性中发挥重要作用。