研究背景我们的前期研究发现,激活TLR4分子能够显著提高受照小鼠的生存率,表现出很好的辐射损伤防护作用。由于TLR4介导的功能十分广泛,其激动剂的辐射防护作用与其他副作用同时存在,限制了激动剂在损伤防治中的转化应用。因此,需要为研究放射损伤防治寻找新思路。TLR4信号通路中可能存在与机体辐射敏感性相关的重要调控分子,寻找这些新的通路或调控分子,对于突破难治性放射损伤防治瓶颈问题具有十分重要的意义。研究内容一、miR-351在辐射敏感性中的调控作用及靶点研究1、miRNA芯片筛选TLR4辐射防护中相关差异分子;2、miR-351的生物信息学分析;3、miR-351在细胞中的过表达及抑制模型的构建;4、上调及下调miR-351对细胞辐射敏感性的影响;5、iTRAQ筛选miR-351相关差异蛋白;6、荧光报告基因进行miR-351下游靶点的验证。二、miR-351对造血干细胞功能的调控作用1、miR-351基因敲除小鼠的构建;2、miR-351基因敲除对小鼠外周血的影响;3、miR-351基因敲除对小鼠造血干细胞的影响;4、miR-351基因敲除对骨髓CMP、MEP和GMP的影响;5、miR-351基因敲除对骨髓红系及巨核细胞的影响;6、miR-351基因敲除对骨髓CLP的影响;7、过表达Bcl2l13对原代HSPC细胞周期及增殖的作用。三、miR-351对小鼠结肠癌细胞辐射敏感性的调控作用1、LPS对小鼠的辐射损伤防护作用研究;2、LPS对小鼠IL-6、IL-11和PGE2等细胞因子的影响;3、LPS对CT26细胞辐射敏感性的影响;4、LPS在体外对miR-351表达水平的影响;5、miR-351对CT26细胞辐射敏感性的影响;6、miR-351对CT26细胞IL-6、IL-11和PGE2表达水平的影响;7、miR-351对IL-6、IL-11和PTGS2的靶向作用研究。研究方法1、细胞总RNA抽提使用RNA抽提试剂盒抽提细胞总RNA,完成后使用紫外分光光度计测定RNA浓度,并放于-80℃保存。2、逆转录及定量PCR以抽提所得总RNA为模板,使用逆转录试剂盒进行逆转录反应,所得cDNA产物再使用定量PCR试剂盒对目的基因进行半定量分析。3、细胞总蛋白提取收集各组细胞沉淀,使用蛋白裂解液提取细胞总蛋白,使用BCA试剂盒测定所得蛋白浓度,然后按比例加入上样缓冲液混匀,100℃水浴后于-20℃保存。4、蛋白电泳及Western Blot根据各组蛋白样品浓度上样,进行SDS-PAGE电泳,然后进行转膜、封闭、一抗及二抗的孵育,最后显影,对各组目的蛋白含量进行半定量分析。5、细胞凋亡检测使用细胞凋亡检测试剂盒通过AnnexinⅤ/PI双染法对各组细胞进行标记,然后使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。6、细胞活力检测使用CCK-8试剂进行细胞活力检测,各组细胞处理完成后,相应时间点加入CCK-8液,孵育后使用酶标仪检测吸光度,分析比较各组细胞的细胞活力。7、细胞转染使用lipo3000转染试剂,将目的质粒或miRNA导入细胞中,转染后相应时间点处理细胞,进行后续实验。8、病毒包装及感染将病毒包装所需质粒共转染入293T细胞中,48小时后收集培养上清,离心去除细胞碎片后-80℃保存。病毒感染时,按病毒液:细胞培养及=1:1的比例混合,然后加入待感染细胞,筛选出稳转细胞。9、同位素标记相对和绝对定量技术iTRAQ提取样品中总蛋白,取出一部分做蛋白浓度测定及SDS-PAGE检测,另取部分进行胰蛋白酶酶解及标记,然后取等量的各标记样品混合后进行色谱分离,最后对样品进行LC-MS/MS分析及数据分析。10、miRNA芯片参照芯片标准流程进行样本的标记、芯片的杂交以及洗脱。首先,总RNA经过去磷酸化,变性,再进一步用Cyanine-3-CTP（Cy3）标记。标记好的RNA纯化后和芯片杂交,洗脱后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）扫描得到原始图像。最后进对原始数据进行处理和分析。11、荧光素酶报告基因培养生长状态良好的细胞,按实验设计的组别进行质粒转染实验。转染24小时后荧光显微镜下观察细胞内荧光标记基因的表达情况,然后使用相应试剂盒处理细胞、进行Luciferase表达检测。12、基因敲除小鼠构建利用CRISPR技术分别在目标基因miR-351成熟区或者两端进行剪切,小鼠受精卵细胞通过NHEJ的DNA修复,将目标DNA片段删除,而实现miR-351非编码基因敲除的目的。13、DNA琼脂糖凝胶电泳取动物组织样本进行直接PCR得到产物DNA,产物与上样缓冲液混匀后进行上样,电泳,然后进行成像分析。14、小鼠外周血细胞计数去小鼠外周血加入抗凝管中混匀,使用血细胞计数仪对外周血各类血细胞进行分类计数。15、小鼠骨髓有核细胞（BMCs）悬液的制备颈椎脱臼处死小鼠后取股骨,冲出骨髓去除红细胞后制备成骨髓细胞悬液,用于进行进一步实验。16、小鼠脾脏及胸腺细胞悬液的制备颈椎脱臼处死小鼠后取脾脏或胸腺,使用钢网进行研磨,去除红细胞并制备成单细胞悬液,用于进一步实验。17、流式细胞仪分析对于不同阶段的造血干细胞及前体细胞,使用相应的表面标记物抗体进行标记染色,然后使用流式细胞仪进行对不同细胞亚群的数量和比例进行分析。18、小鼠造血祖细胞分离及培养无菌条件下取小鼠骨髓细胞,去除红细胞后制备成细胞悬液,使用小鼠造血祖细胞分离纯化试剂盒通过免疫磁珠法进行分选,所得原代细胞继续进行培养。所用培养基为StemSpan^TMSFEM,添加细胞因子为murine IL-3（20 ng/ml）,murine SCF（100ng/ml）和murine Flt3（100 ng/ml）。19、小鼠骨髓移植无菌条件下取小鼠骨髓细胞,去除红细胞后制备成细胞悬液,计数然后调整细胞浓度至1×10⁷/ml,然后通过尾静脉将细胞悬液注入受体小鼠,0.2ml/只。受体小鼠继续喂养,用于进一步实验。20、细胞周期检测收集各组待测细胞,用75%乙醇固定过夜,然后收集细胞,使用细胞周期染液进行重悬,孵育完成后用流式细胞仪检测,分析处于不同细胞周期的细胞比例。21、统计学分析使用SPSS18.0和GraphPad Prism5对数据进行处理和分析。对于两独立样本的比较,采用t检验（正态分布且方差齐性）或Wilcoxon秩和检验（不满足正态分布和方差齐性）;多组比较采用one-way ANOVA（单因素,满足正态分布且方差齐性）,two-way ANOVA（两因素,满足正态分布且方差齐性）或K-W秩和检验（不满足正态分布和方差齐性）。P<0.05时认为具有统计学差异。研究结果一、miR-351在辐射敏感性中的调控作用及靶点研究1、miRNA芯片结果提示miR-351在TLR4基因敲除小鼠中上调最为显著以TLR4基因敲除小鼠和野生型小鼠为研究对象分析差异表达的miRNA。结果发现,在电离辐射条件下,TLR4基因敲除小鼠中上调最明显的miRNA为miR-351。2、miR-351的生物信息学分析结果提示其可以被多个转录因子所调控miR-351定位于X染色体,进一步对miR-351启动子区前3000碱基序列进行检索分析发现,miR-351启动子区潜在23个TFBS位点及对应的TF,此23个TFBS位点可能结合8个TF。3、miR-351在细胞中的过表达及抑制模型的构建定量PCR结果显示,转染miR-351 mimics可使miR-351的表达水平在NIH/3T3、BALB/3T3以及3T3-L1分别上调250、550及125倍（P<0.05）。同时,转染miR-351inhibitor可使miR-351的表达水平在三种细胞系中下调约40%（P<0.05）。4、miR-351过表达增加细胞辐射敏感性miR-351过表达能够增加照射细胞凋亡率和降低照后细胞活力（P<0.05）。相反地,抑制miR-351能够提高照后细胞活力同时减少辐射诱导的细胞凋亡,但结果无统计学差异（P>0.05）。5、iTRAQ筛选miR-351相关差异蛋白使用iTRAQ的方法对miR-351过表达以及对照组的差异蛋白进行分析。酶解标记后的样品利用液质联用技术进行分析,分析后进行数据库检索。BALB/3T3组共筛选出差异蛋白249个,3T3-L1组筛选出差异蛋白86个,NIH/3T3组筛选出差异蛋白214个。6、miR-351通过3’UTR依赖的方式靶向Bcl2l13双荧光素酶报告基因结果表明miR-351作用后,Bcl2l13 3’UTR活性下降28%（P<0.01）;将Bcl2l13 3’UTR进行突变后,在miR-351作用下,3’UTR活性较野生型增高（P<0.01）。二、miR-351对造血干细胞功能的调控作用1、miR-351基因敲除小鼠的构建采用CRIPSR/Cas9的基因编辑技术构建miR-351基因敲除小鼠。选取miR351-g51和miR351-g34体外转录成mRNA,与Cas9蛋白一起显微注射到小鼠受精卵中,一共注射60个受精卵,出生6只小鼠。两周龄后,对出生的小鼠进行测序,共有两只小鼠发生了片段删除,miR-351基因敲除小鼠构建成功。2、miR-351敲除促进造血功能miR-351基因敲除小鼠外周血白细胞、红细胞及血小板计数均高于野生型小鼠,但无统计学差异（P>0.05）,同时骨髓有核细胞计数升高（P<0.05）。骨髓移植结果显示miR-351敲除组外周血各系细胞计数高于对照组（P<0.05）。3、miR-351敲除提高造血干细胞的数量miR-351敲除能够提高骨髓中LSK细胞的数量和比例（P<0.05）。我们通过Flt3继续对LSK细胞进行分型,结果显示miR-351敲除小鼠中多能祖细胞的比例和数量显著上调（P<0.05）。4、miR-351敲除促进造血干细胞的自我更新正常小鼠的LSK细胞大多数处于G0期,而miR-351敲除小鼠G0期的LSK细胞比例明显下调,S及G2/M期细胞比例增加（P<0.05）。5、miR-351敲除促进髓系的分化使用流式分别检测了CMP、GMP和MEP的数量和比例的变化,结果表明这三者在miR-351敲除小鼠中均升高（P<0.05）。髓系细胞检测结果发现,miR-351敲除能够提高髓系细胞的数量和比例（P<0.05）。6、miR-351敲除促进红系及巨核系的分化检测了各组小鼠骨髓红系前体细胞和巨核前体细胞的数量。流式检测结果表明,miR-351敲除小鼠各阶段红细胞前体均高于野生型（P<0.05）。同时,miR-351敲除小鼠骨髓中巨核细胞比例同样高于野生型（P<0.05）。7、miR-351敲除对淋系的分化无明显作用对骨髓中CLP的检测发现miR-351敲除小鼠CLP比例和数量无明显改变。接着,我们又对骨髓中B细胞及前体细胞、胸腺中T细胞进行了检测,发现其数量和比例在miR-351敲除小鼠和野生型小鼠之间无明显差异。8、体外过表达Bcl2l13促进造血干祖细胞增殖体外培养小鼠造血干祖细胞,检测细胞周期发现过表达Bcl2l13能够上调处于S及G2/M期细胞的比例。同时,定量PCR结果显示过表达Bcl2l13能够下调Cdkn1a和Bmi-1的水平,同时上调HoxB4和β-catenin的表达水平（P<0.05）。三、miR-351对小鼠结肠癌细胞辐射敏感性的调控作用1、低剂量LPS通过激活TLR4发挥辐射防护效果小鼠予以LPS处理后（照射前24小时和2小时分别给药,0.05 mg/只）,在不同剂量全身照射时（7Gy、9Gy和12Gy）,LPS均能提高受照小鼠生存率（P<0.05）。无辐射条件下,TLR4敲除小鼠分别予以PBS和LPS（1 mg/只）处理,结果两组小鼠均全部存活。在7Gy全身照射下,TLR4敲除小鼠分别予以PBS和LPS（0.05 mg/只）处理,结果两组小鼠在20天内全部死亡,两者无统计学差异。2、LPS通过TLR4依赖的途径上调IL-6、IL-11及PGE2等细胞因子小鼠予以LPS（0.05mg/只）处理后,IL-6、G-CSF、TNF-α、IL-11和PGE2的表达水平显著上调（P<0.05）。7Gy全身照射条件下,LPS同样能够上调上述细胞因子的表达水平。进一步使用TLR4基因敲除小鼠的研究表明,TLR4敲除可以明显降低LPS对细胞因子的上调效应（P<0.05）。3、低剂量LPS减轻小鼠结肠癌细胞CT26的辐射损伤高浓度LPS（>10 ug/ml）表现出显著的毒性,细胞活力明显下降,低浓度LPS（<1μg/ml）反而表现出促增值效应,细胞活力增加。细胞予以LPS处理（1μg/ml和0.1μg/ml）,而后进行照射（4Gy、8Gy和12Gy）,结果表明两种浓度LPS均能显著提高照后细胞活力（P<0.05）。LPS处理细胞后24收集培养上清,然后通过ELISA的方法检测IL-6、G-CSF、TNF、IL-11和PGE2的表达水平,结果发现上述细胞因子的表达水平均升高（P<0.05）。用不同的细胞因子处理CT26细胞后发现IL-6、IL-11及PGE2处理能够显著提高照射后细胞活力,以12Gy组最为明显（P<0.05）。4、LPS下调CT26细胞中miR-351的水平通过定量PCR检测了LPS（1μg/ml）处理CT26细胞后miR-351的表达变化,结果发现LPS处理后,miR-351的表达水平随着时间而逐渐下调并在24小时下降至最低（P<0.05）。同时,用不同浓度的LPS处理24小时后检测miR-351表达水平,发现LPS对miR-351的抑制作用随着浓度增加逐渐增强。5、过表达miR-351增加CT26辐射敏感性miR-351过表达能降低不同剂量照射后细胞活力（P<0.05）,同时,miR-351能够部分逆转LPS的效应。miR-351的下调实验结果表明抑制miR-351表达水平能够提高照后CT26的细胞活力（P<0.05）。6、过表达miR-351下调IL-6、IL-11和PGE2的表达细胞实验结果表明,过表达miR-351能够显著降低IL-6、IL-11和PGE2的表达水平（P<0.05）,同时过表达miR-351能够逆转LPS对上述细胞因子的上调作用。miR-351的抑制实验结果发现下调miR-351的水平后,IL-6、IL-11和PGE2的表达水平升高（P<0.05）。最后,细胞同时予以LPS、miR-351和不同细胞因子进行处理,然后发现12Gy照射条件下,IL-6、IL-11和PGE2能够逆转miR-351的效应。7、miR-351通过3’UTR依赖的方式下调IL-11使用荧光报告基因的方法检测miR-351与IL-6、IL-11和PGE2是否存在靶点调控。实验结果发现,miR-351作用后,IL-11的3’UTR活性显著下降（P<0.05）,提示miR-351对其有靶向调控作用。突变实验表明,将IL-11的3’UTR突变后,miR-351的抑制作用消失。分析讨论本研究使用了miRNA芯片的方法进行组学的分析发现,在电离辐射条件下,TLR4基因敲除小鼠中上调最明显的为miR-351。体外研究发现miR-351上调能够增加细胞对辐射的敏感性。紧接着,我们证明了miR-351能够通过3’UTR依赖的方式靶向Bcl2l13从而下调其的表达水平。Bcl2l13属于Bcl2家族分子,多个研究表达Bcl2l13能够抑制凋亡,并在多种肿瘤组织中高表达,与患者的不良预后相关。因此,我们的实验结果提示miR-351能够通过下调Bcl2l13的表达,从而起到辐射增敏的作用。通过对miR-351基因敲除小鼠的研究,我们发现miR-351敲除能够促进骨髓造血。接着我们发现,miR-351敲除能够促进造血干细胞的自我更新。然后,我们又分别检测了骨髓中各阶段造血前体细胞的变化,发现miR-351敲除小鼠骨髓中各髓系前体细胞均升高,而淋系无明显变化。最后,体外实验发现Bcl2l13能够提高处于S及G2/M期造血祖细胞的比例,同时影响造血干细胞扩增相关基因的表达。上述结果说明抑制miR-351能够上调Bcl2l13的表达,进而起到促进造血的作用。为了进一步阐明miR-351的生物学功能,我们又研究了其对肿瘤辐射敏感性的影响。我们发现miR-351过表达能够提高CT26细胞的辐射敏感性,同时能够部分逆转LPS的作用。进一步地,我们发现miR-351能够抑制IL-6、IL-11和PGE2的表达,而IL-6、IL-11和PGE2已经被实验证实具有显著的辐射损伤防护效应。因此,我们认为miR-351通过下调上述细胞因子的水平来增加肿瘤细胞的辐射敏感性。这为肿瘤放疗的增敏提供了新的分子靶点。综上所述,本课题通过从TLR4入手,寻找到了TLR4信号通路中对机体辐射敏感性起着重调控作用的miR-351,为电离辐射防护和肿瘤放疗增敏提供了新的策略和靶点。