前言 经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)是心血管病治疗学上的一项重大突破，但再狭窄(RS)的高发生率严重影响了PTCA的远期疗效。目前认为，RS主要机理为扩张动脉段的弹性回缩、血管平滑肌细胞(VSMC)迁移与增殖、细胞外基质合成、管壁重塑以及血栓的参入与机化。在再狭窄形成过程中发挥作用的各种活性物质和生长因子均通过特异受体，经过细胞内信号传递产生转录因子，启动特定核内基因的表达而产生生物学效应。丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内多种促细胞增殖信息传递的共同通路或称会聚点，是细胞表型变化和增殖的关键酶。蛋白激酶C(PKC)不仅是细胞外信号引起细胞浆内短期生物效应的重要通路，而且在核反应中亦具有重要作用。PKC作为MAPK的上游信号分子，PKC可激活MAPK。血管内皮生长因子(VEGF)是一种特异的内皮细胞促分裂剂，对血管平滑肌细胞、成纤维细胞无促分裂作用。VEGF在再狭窄的防治中可能起重要作用。通心络由河北以岭药业集团研制，已广泛应用于冠心病治疗。本实验通过制作大鼠动脉球囊损伤模型，使用通心络进行干预治疗，旨在从分子生物学水平证实通心络可以从多环节抑制内膜增生及再狭窄机制的研究。 实验材料与方法 1．实验动物：健康雄性Wistar大鼠105只，体重300-350g，周龄14-16周。中国医科大学实验动物部提供。 2．动脉球囊损伤模型的建立：雄性Wistar大鼠105只，体重300～350g。按照Deman等方法改良制备大鼠主动脉球囊成形术模型。经股动脉插入自制2F Fogarty球囊导管至胸主动脉，损伤扩张腹主动脉。 3．实验动物分组：球囊损伤组45只，术后3d、7d和14d各15只。损伤后给药组45只，术后3d、7d和14d各15只。正常对照组15只。 4.动物处死及取材:动物称重，戊巴比妥钠腹腔麻醉。肝素生理盐水灌流。分别取腹主动脉3.ocm，截成3段。分别置于10%甲醛液、2.5%戊二醛固定、液氮罐中冷冻，后置于一70℃深冻冰箱保存。 5.病理标本制作 (1)光镜标本:10%甲醛固定，石蜡包埋，连续冰冻切片，行HE染色。 (2)电镜标本:2.5%戊二醛固定，l%饿酸后固定，Epon 812浸透包埋，超薄切片分铀·铝染色。 6.血管组织MAPK活性测定:以髓磷脂碱性蛋白(MBP)为底物，利用【r一3，P」ATP体外标记磷酸化方法进行MAPK活性测定。 7.血管组织PKC活性测定:以组蛋白为底物，利用〔r一32P〕ATp体外标记磷酸化方法进行PKC活性测定。 8.免疫印迹法(Western Bfot)检测ERK，、ERK:、PKC。、VEGF的蛋白表达:用ERKI、ERKZ、PKc。、vEGF特异性抗体检测各不同时期血管组织蛋白提取液中ERK，、ERK:、PKC。、VEGF蛋白表达量。 9.逆转录一聚合酶链反应(RT一PCR)检测ERK:、ERKZ、PKC。、VEGF基因表达:用Trizol总RNA提取试剂提取血管组织总RNA，逆转录合成cD-NA第一链，分别扩增ERK，、ERKZ、PKC。、VEGF的PCR产物，检测mRNA含量。实验结果 1.血管组织MAPK活性变化 球囊损伤后3d、7d和14d血管组织MAPK活性高于正常对照组，以7d组增高最为明显，通心络抑制MAPK活性，以用药后7d最为明显。 2.ERK:和ERKZ的Westem Bfot蛋白表达结果 正常对照组未见ERK，表达，球囊损伤后3d、7d和14d表达增强，以7d组最为明显。通心络抑制ERKI表达，以抑制用药后7d组最为明显。ERKI和ERKZ表达量之间未见明显差异。 3.ERK;和E以ZRT一PCR基因表达结果 正常对照组未见mRNA表达，损伤后3d、7d和14d均见mRNA表达，以7d组最为明显。通心络抑制mRNA表达，以抑制用药后7d最为明显，ERK:和ER凡的表达量之间未见明显差异。 4.血管组织PKC活性变化 球囊损伤后3d、7d和14d血管组织PKC活性高于正常对照组，以7d增高最为明显，通心络抑制PKC活性，以抑制用药后7d组最为明显。 5.PKC。的Westem Bfot蛋白表达结果 正常对照组未见PKC。表达，损伤后3d、7d和14d PKC。表达增强，以7d组最为明显。通心络治疗后PKC。表达降低，以用药后7d组最为明显。 6.PKC。的RT一PCR mRNA测定结果 正常对照组未见PKC。mRNA表达，损伤后3d、7d和14d均出现mRNA表达，7d时最明显。通心络抑制mRNA表达，以用药7d最为明显。 7.VECF的W比tem Blot蛋白表达结果 正常对照组未见VEGF表达，损伤后3d、7d和14d出现表达，以7d组最为明显。通心络治疗后VEGF表达增强，以用药后7d最为明显。 8.VEGF和RT一PCR mRNA表达正常 对照组未见mRNA表达，损伤后 3d、7d和14d出现mRNA表达，以7d组最为明显。通心络治疗后VEGF mRNA表达增强，以用药后7d最为明显。 9.血管形态学变化:正常对照组大鼠腹主动脉内皮完整。球囊损伤后3d，可见内皮细胞剥脱。7d时血管内膜增生，14d后内膜增生更明显，通心络治疗组内膜增生减轻。 10.电镜结果:正常对照组内皮细胞完整。平滑肌细胞排列整齐。球囊损伤后内皮细胞受损，平滑肌细胞被拉长变形。讨论 在再狭窄的形成过程中发挥作用的各种活性物质和生长因子均通过特异的受体，经过细胞内信?