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脑胶质瘤是大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的最常见的原发性颅脑恶性肿瘤之一,具有发病率高、复发率高、死亡率高的特点。由于脑胶质瘤细胞大多数呈浸润性生长,与周围正常组织分界不清,而且目前临床诊断脑胶质瘤多局限于基础形态学,手术治疗并不能完全将肿瘤组织切除,且术后易复发;化疗和放疗常作为术后辅助治疗手段,不能特异杀伤脑胶质瘤细胞,同时还可能产生中枢神经系统毒副作用,因此恶性脑胶质瘤病人的治愈率低,预后差,确诊后的平均生存周期不超过15个月。
长链非编码RNA(long noncoding RNA, LncRNA)是一类长度超过200nt的RNA分子。目前认为,大部分LncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ, polⅡ)转录生成的,由polⅡ转录形成的初产物。它们位于细胞核或胞质内,由于缺乏开放阅读框而不具备编码蛋白的能力。近年来,有关LncRNA的报道不断增加,对于LncRNA的研究也不断深入。LncRNA的种类之多,对基因的调控形式也丰富多彩。至今已证实了L ncRNA不仅在保护端粒结构的完整性、调控免疫系统的稳定性、影响胚胎的生长发育、维持各器官组织功能方面发挥着重要的作用,更与肿瘤的发生发展密切相关。LncRNA的过表达或敲除会引起包括出生缺陷、肿瘤等人类多种疾病。因此,可以通过改变Lnc RNA 的表达量来降低肿瘤细胞的恶性程度,这可能是一个很有前景的治疗方案。
据文献报道,在正常脑组织或者瘤旁正常脑组织以及不同级别的脑胶质瘤间存在的表达差异的LncRNA可能在脑胶质瘤的发生发展中发挥重要的生物学作用。LncRNA R P5和LncRNA RP11-252E在脑胶质瘤病人的癌组织标本中高表达,然而,LncRNA RP 5和LncRNA RP11-252E对脑胶质瘤细胞的增殖、迁移侵袭、周期、凋亡等功能是否有影响和具体的作用机制尚不明确。因此,充分了解LncRNA RP5和LncRNA RP11-252 E在脑胶质瘤中的功能和具体分子机制,可以为脑胶质瘤的临床诊断、治疗和预后提供新的思路。基于以上研究背景,本研究选择人脑胶质瘤细胞系U251和U87作为研究模型进行有关研究
目的
探究LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E在脑胶质瘤细胞中的生物学功能与作用机制,为一些特异性表达的LncRNA作为脑胶质瘤临床诊断的标志物和治疗靶点提供新的研究方向和理论依据。
方法
1、通过查找相关文献,收集一些在脑胶质瘤的癌组织和癌旁组织表达量存在差异的Ln cRNA,并筛选出表达量差异比较明显的LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E作为本课题的研究对象。
2、在体外分别设计并合成用于沉默LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E 的SiRNA,采用瞬时转染方法,分别检测敲降LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E后对U87脑胶质瘤细胞和U251脑胶质瘤细胞在体外增殖的影响。
3、以PLKO.1为载体分别构建LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E低表达的慢病毒稳态细胞株。
4、采用CCK8、平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell实验、Annexin V-FITC/PI 双染、PI染色等分别检测LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E低表达的慢病毒稳态株细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力、细胞周期以及细胞凋亡情况的变化。
5、采用qPCR、Western Blot等实验初步研究在体外LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E对脑胶质瘤周期、凋亡的作用机制。
结果
1、成功构建LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E低表达的慢病毒稳转细胞株。
2、下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E的表达,在体外均能够有效的抑制U87和U251肿瘤细胞的增殖能力,克隆形成能力和迁移侵袭能力。
3、下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E的表达,在体外均能够促进U87和U251肿瘤细胞的凋亡并且明显地改变了肿瘤细胞的周期,将U87和U251肿瘤细胞阻滞在G 1期。
4、下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E的表达,均能够使细胞周期相关蛋白Cyc linD1、CDK1表达降低,使抑癌基因PTEN表达增加。
5、下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E的表达,均能够使细胞凋亡相关蛋白Cas pase-3、Caspase-9、BAX表达增加,使凋亡抑制蛋白Bcl-2表达减少。
结论
本研究首先在相关文献中查找出一些在脑胶质瘤的正常组织或癌旁组织和癌组织表达量存在差异的LncRNA,经过整理挑选在脑胶质瘤患者癌组织中表达量显著高于癌旁组织的LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E作为研究对象。分别下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E在脑胶质瘤细胞U87和U251的表达均可有效抑制脑胶质瘤细胞U87和U251的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力,并促进脑胶质瘤细胞U87和U25 1凋亡,明显影响脑胶质瘤细胞U87和U251周期。进一步机制研究表明下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E可以通过升高脑胶质瘤细胞U87和U251中的PTEN的表达,降低脑胶质瘤细胞中的CyclinD1和CDK1的表达,从而影响脑胶质瘤细胞的细胞周期,使脑胶质瘤细胞阻滞在G0/G1期;下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E可以通过升高脑胶质瘤细胞U87和U251中的Caspase-3、Caspase-9、BAX的表达,降低脑胶质瘤细胞中的Bcl-2的表达,从而诱导脑胶质瘤细胞凋亡。上述实验结果表明 LncRNA R P5和LncRNA RP11-252E在脑胶质瘤的形成和发展过程中起重要作用。
长链非编码RNA(long noncoding RNA, LncRNA)是一类长度超过200nt的RNA分子。目前认为,大部分LncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ, polⅡ)转录生成的,由polⅡ转录形成的初产物。它们位于细胞核或胞质内,由于缺乏开放阅读框而不具备编码蛋白的能力。近年来,有关LncRNA的报道不断增加,对于LncRNA的研究也不断深入。LncRNA的种类之多,对基因的调控形式也丰富多彩。至今已证实了L ncRNA不仅在保护端粒结构的完整性、调控免疫系统的稳定性、影响胚胎的生长发育、维持各器官组织功能方面发挥着重要的作用,更与肿瘤的发生发展密切相关。LncRNA的过表达或敲除会引起包括出生缺陷、肿瘤等人类多种疾病。因此,可以通过改变Lnc RNA 的表达量来降低肿瘤细胞的恶性程度,这可能是一个很有前景的治疗方案。
据文献报道,在正常脑组织或者瘤旁正常脑组织以及不同级别的脑胶质瘤间存在的表达差异的LncRNA可能在脑胶质瘤的发生发展中发挥重要的生物学作用。LncRNA R P5和LncRNA RP11-252E在脑胶质瘤病人的癌组织标本中高表达,然而,LncRNA RP 5和LncRNA RP11-252E对脑胶质瘤细胞的增殖、迁移侵袭、周期、凋亡等功能是否有影响和具体的作用机制尚不明确。因此,充分了解LncRNA RP5和LncRNA RP11-252 E在脑胶质瘤中的功能和具体分子机制,可以为脑胶质瘤的临床诊断、治疗和预后提供新的思路。基于以上研究背景,本研究选择人脑胶质瘤细胞系U251和U87作为研究模型进行有关研究
目的
探究LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E在脑胶质瘤细胞中的生物学功能与作用机制,为一些特异性表达的LncRNA作为脑胶质瘤临床诊断的标志物和治疗靶点提供新的研究方向和理论依据。
方法
1、通过查找相关文献,收集一些在脑胶质瘤的癌组织和癌旁组织表达量存在差异的Ln cRNA,并筛选出表达量差异比较明显的LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E作为本课题的研究对象。
2、在体外分别设计并合成用于沉默LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E 的SiRNA,采用瞬时转染方法,分别检测敲降LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E后对U87脑胶质瘤细胞和U251脑胶质瘤细胞在体外增殖的影响。
3、以PLKO.1为载体分别构建LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E低表达的慢病毒稳态细胞株。
4、采用CCK8、平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell实验、Annexin V-FITC/PI 双染、PI染色等分别检测LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E低表达的慢病毒稳态株细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力、细胞周期以及细胞凋亡情况的变化。
5、采用qPCR、Western Blot等实验初步研究在体外LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E对脑胶质瘤周期、凋亡的作用机制。
结果
1、成功构建LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E低表达的慢病毒稳转细胞株。
2、下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E的表达,在体外均能够有效的抑制U87和U251肿瘤细胞的增殖能力,克隆形成能力和迁移侵袭能力。
3、下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E的表达,在体外均能够促进U87和U251肿瘤细胞的凋亡并且明显地改变了肿瘤细胞的周期,将U87和U251肿瘤细胞阻滞在G 1期。
4、下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E的表达,均能够使细胞周期相关蛋白Cyc linD1、CDK1表达降低,使抑癌基因PTEN表达增加。
5、下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E的表达,均能够使细胞凋亡相关蛋白Cas pase-3、Caspase-9、BAX表达增加,使凋亡抑制蛋白Bcl-2表达减少。
结论
本研究首先在相关文献中查找出一些在脑胶质瘤的正常组织或癌旁组织和癌组织表达量存在差异的LncRNA,经过整理挑选在脑胶质瘤患者癌组织中表达量显著高于癌旁组织的LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E作为研究对象。分别下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E在脑胶质瘤细胞U87和U251的表达均可有效抑制脑胶质瘤细胞U87和U251的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力,并促进脑胶质瘤细胞U87和U25 1凋亡,明显影响脑胶质瘤细胞U87和U251周期。进一步机制研究表明下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E可以通过升高脑胶质瘤细胞U87和U251中的PTEN的表达,降低脑胶质瘤细胞中的CyclinD1和CDK1的表达,从而影响脑胶质瘤细胞的细胞周期,使脑胶质瘤细胞阻滞在G0/G1期;下调LncRNA RP5和LncRNA RP11-252E可以通过升高脑胶质瘤细胞U87和U251中的Caspase-3、Caspase-9、BAX的表达,降低脑胶质瘤细胞中的Bcl-2的表达,从而诱导脑胶质瘤细胞凋亡。上述实验结果表明 LncRNA R P5和LncRNA RP11-252E在脑胶质瘤的形成和发展过程中起重要作用。