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目的：
利用Westernblotting方法检测不同病因造成ONFH患者的股骨头样本大致病理形态与其中成骨与成血管相关蛋白的表达情况，为后续SONFH相关基础实验与临床治疗提供一定的理论基础与参照；再通过观察补肾活血胶囊对GC相关的ONFHSD大鼠骨组织重建及血管新生的影响和对GC处理的BMSCs成骨-成血管分化的影响，进一步研究补肾活血胶囊对动物与细胞实验中的成骨、成血管及Hedgehog信号通路相关因子的影响机制。
方法：
1.收集本院在2017年12月至2019年12月期间接受THA手术后的ONFH与股骨颈骨折患者的股骨头样本，挑选符合标准的股骨头按病因分别归入对照组、特发组、酒精组、激素组以及创伤术后组，采用Westernblotting检测不同病因坏死骨组织的成骨与成血管相关指标的蛋白表达情况。
2.通过使用对SD大鼠臀肌注射MPS的方法建立GC相关的ONFH大鼠模型，随后给予不同剂量的补肾活血胶囊加以干预，8周后通过组织病理学观察、荧光定量PCR检测与Westernblotting分析在不同层面综合评价补肾活血胶囊对GC相关的ONFH大鼠骨组织重建及血管新生的影响。
3.运用贴壁法提纯与扩增SD大鼠的BMSCs，并使用不同剂量的补肾活血胶囊含药血清与Dex进行干预培养，观察BMSCs的生长状况、增殖能力以及分化潜能，并采用细胞划痕实验、qPCR检测与Westernblotting分析细胞中成骨、成血管与Hedgehog信号通路相关因子的蛋白表达变化；同时，建立SD大鼠RAOECs与BMSCs共培养体系，并对共培养后的RAOECs进行血管生成实验和Transwell迁移实验，观察其在补肾活血胶囊含药血清与Dex干预培养下的成血管能力与细胞活性的变化。
结果：
1.通过观察各组股骨头样本的大致形态与冠状面，发现不同病因ONFH患者股骨头样本在大致形态与剖面具有较为相似的病理表现，同时有相似的坏死和修复的组织学特征；Westernblotting结果：在成骨方面，ALP蛋白的表达除创伤术后组显著低于对照组外，其余各组间均无显著差异(P＞0.05)；CollgenI蛋白只有特发组与对照组没有统计学差异(P＞0.05)，其余各组表达量均显著低于对照组(P＜0.05)；与对照组相比，激素组、创伤术后组的OPN蛋白表达量均显著降低(P＜0.05)，而特发组、酒精组则无显著差异(P＞0.05)；对照组中RUNX2的蛋白表达量分别显著高于其余各组(P＜0.05)；在成血管方面，不同病因造成的ONFH股骨头样本中CD31、VEGFA与KDR血管生成相关标记物蛋白的表达较对照组均存在显著下降的情况(P＜0.05)；而VWF的蛋白表达量在各组间均未有显著差异(P＞0.05)；在Hedgehog信号通路方面，Shh的蛋白表达量在不同病因的ONFH患者股骨头样本内不存在显著差异(P＞0.05)；与对照组相比，酒精组与创伤术后组样本中信号通路下游细胞内信号因子Gli1的蛋白表达量出现了显著下降(P＜0.05)，而特发组、激素组则未见显著差异(P＞0.05)；各组中细胞内信号因子Gli2的蛋白表达量较对照组均出现了显著减少(P＜0.05)。
2.SD大鼠干预8周后，各组大鼠股骨头样本大体观无明显差异；软件分析HE染色结果显示：CG组骨小梁面积比率显著高与MG组(P＜0.05)，LDG、MDG、HDG三组数据则均显著高于MG组(P＜0.05)；而大鼠空骨陷窝率情况与骨小梁面积比率趋势一致，同为CG组显著高于MG(P＜0.05)且LDG、MDG、HDG剂量三组均显著高于MG组(P＜0.05)；软件分析免疫组织化学染色结果显示：与CG组相比，MG组大鼠股骨头成骨相关指标ALP、CollgenI、OPN与RUNX2不同程度的表达减少(P＜0.05)；而灌胃不同剂量补肾活血胶囊的三个组则显著高于MG组(P＜0.05)；MG组成血管相关指标CD31、VEGFA、KDR与VWF在股骨头中的表达强度相比较CG组均有明显下降(P＜0.05)，而不同剂量补肾活血胶囊灌胃组与MG组相比均有显著升高(P＜0.05)；qPCR检测结果显示：在成骨方面，CG组中ALP、CollgenI和RUNX2的mRNA表达均显著高于MG组(P＜0.05)；LDG组中CollgenI与RUNX2的表达显著高于MG组(P＜0.05)；MDG组中ALP与CollgenI的表达显著高于MG组(P＜0.05)；而HDG组CollgenI的表达显著高于MG组(P＜0.05)；在成血管方面，CG中CD31、VEGFA和KDR的mRNA表达均显著高于MG组(P＜0.05)；LDG组中只有VEGFA的mRNA表达量明显多于MG组(P＜0.05)；MDG组中CD31与VEGFA的mRNA表达量均显著多于MG组(P＜0.05)；而HDG组VEGFA的mRNA表达量明显少于MG组(P＜0.05)；在Hedgehog信号通路方面，CG组中Shh、Gli1和Gli2的mRNA表达量均明显多于MG组(P＜0.05)；LDG组中则有Gli1和Gli2的表达显著高于MG组(P＜0.05)；MDG组与HDG组中Shh、Gli1和Gli2的mRNA表达情况均显著高于MG组(P＜0.05)；Westernblotting结果分析显示：CG组样本中成骨相关ALP、CollgenI、OPN和RUNX2蛋白表达均显著高于MG组，而经过补肾活血胶囊LDG组中CollgenI、OPN和RUNX2三种蛋白表达情况均显著高于MG组表达(P＜0.05)；MDG组中ALP、CollgenI和OPN三种蛋白表达均显著高于MG组(P＜0.05)；HDG组显中ALP与CollgenI著高于MG组(P＜0.05)；CG样本中成血管相关CD31、VEGFA、KDR和VWF四种蛋白表达均显著高于MG组，而LDG组中VEGFA、KDR两种蛋白表达情况均显著高于MG组表达(P＜0.05)；而MDG组中VEGFA与KDR两种蛋白表达均显著高于MG组(P＜0.05)，而CD31与VWF的表达则显著低于MG组(P＜0.05)；HDG组显中KDR和VWF著高于MG组(P＜0.05)；CG组样本中Hedgehog信号通路相关Shh、Gli1和Gli2蛋白三种蛋白表达均显著高于MG组，而经过补肾活血胶囊干预的LDG组中仅有Gli2蛋白表达情况显著高于MG组表达(P＜0.05)；而MDG组中Shh和Gli2两种蛋白表达均显著高于MG组(P＜0.05)；HDG组显中也仅有Gli2蛋白的表达著高于MG组(P＜0.05)。
3.本研究采用贴壁法可以提纯高纯度的原代SD大鼠BMSCs；原代BMSCs可顺利进行成骨、成脂与成软骨诱导分化；不同浓度的补肾活血胶囊含药血清不进对原代BMSCs具有促进增殖的作用，并且还可显著提高经Dex处理过的原代BMSCs的增殖活性；成骨诱导3周后，茜素红染色显示不同浓度补肾活血胶囊含药血清低、中、高剂量组与对照组染色结果相似，较模型组显著升高；BMSCs划线实验24h时，CG组与LDG、MDG、HDG三组的划线平均宽度均显著低于DG组(P＜0.05)，且48h时趋势与24h时保持一致；将与SD大鼠BMSCs在不同浓度补肾活血胶囊含药血清与Dex进行共培养后的RAOECs进行血管生成实验，对CG与LDG、MDG、HDG三组的血管分支数量指标均显著高于MG组(P＜0.05)；而在血管分支总长度指标上，CG组总长度数值显著高于DG组(P＜0.05)，而MDG与HDG组的血管分支总长度显著高于DG组(P＜0.05)；Transwell迁移实验结果表明：DG组迁移的细胞数量显著少于CG组(P＜0.05)；MDG组迁移细胞数则显著多与DG组(P＜0.05)；而LDG、HDG组迁移细胞数与模型组不存在显著差异(P＞0.05)；qPCR结果显示：在Hedgehog信号通路方面，相比较于CG组，DG组中Shh、Gli1和Gli2的mRNA表达量均出现显著减少(P＜0.05)；在含药血清方面，LG、HG组中Shh、Gli1和Gli2指标的mRNA表达量均显著多于CG组(P＜0.05)，而MG组中的Shh和Gli2的mRNA表达情况较CG组均出现显著提高(P＜0.05)；在干预方面，与DG组相比，MDG与HDG组中Shh、Gli1和Gli2各指标的mRNA表达量均出现显著升高(P＜0.05)，而LDG组中的Shh和Gli2表达均显著高于DG组(P＜0.05)；成骨方面，DG组相较于CG组ALP、CollgenI和RUNX2的mRNA表达量均有显著降低(P＜0.05)；在含药血清方面，LG组中ALP、CollgenI和RUNX2的mRNA表达均显著高于CG组(P＜0.05)，而MG与HG组中的ALP和RUNX2表达均显著高于CG组(P＜0.05)；在干预方面，MDG组中ALP、CollgenI和RUNX2的mRNA表达均显著高于DG组(P＜0.05)，LDG组中CollgenI和RUNX2的表达显著高于DG组(P＜0.05)，而HDG组中ALP和CollgenI的表达则显著高于DG组(P＜0.05)；成血管方面：CG组的CD31、VEGFA和KDR的mRNA表达均显著高于DG组(P＜0.05)；LG、MG与HG组中CD31、VEGFA和KDR的mRNA表达均显著高于CG组(P＜0.05)；在干预方面，MDG与HDG组中CD31、VEGFA和KDR的mRNA表达均显著高于DG组(P＜0.05)，LDG组中VEGFA和KDR的mRNA表达量皆显著多于DG组(P＜0.05)；Westernblotting结果分析显示：在Hedgehog信号通路方面，DG组BMSCs的Shh、Gli1和Gli2三种蛋白的表达量相较于CG组均有明显降低(P＜0.05)；LG组中的Shh、Gli1和Gli2各指标蛋白表达程度较CG组有显著增加(P＜0.05)；MG、HG组中Gli1的蛋白表达量与CG组相比也有显著提升(P＜0.05)；干预方面，LDG与MDG组相较于DG组的Shh、Gli1和Gli2三种蛋白表达量均有显著提高(P＜0.05)；而HDG组则只有Gli2蛋白表达显著高于DG组P＜0.05)；在成骨方面，DG组BMSCs的ALP、CollgenI、OPN和RUNX2蛋白表达水平相较于CG组均有明显降低(P＜0.05)；HG组中的ALP、CollgenI、OPN和RUNX2蛋白表达量均显著均高于CG组(P＜0.05)；MG组中CollgenI、OPN和RUNX2的蛋白表达量显著高于CG组(P＜0.05)；LG组中CollgenI和OPN的蛋白表达量显著高于CG组(P＜0.05)；干预方面，MDG与HDG组相较于DG组的ALP、CollgenI、OPN和RUNX2蛋白表达水平方面均有显著提高(P＜0.05)；而LDG组则在ALP、CollgenI和RUNX2的蛋白表达量上显著高于DG组(P＜0.05)；在成血管方面，CG组BMSCs的CD31、VEGFA、KDR和VWF蛋白表达水平均显著高于DG组(P＜0.05)；在CD31和VEGFA蛋白表达水平方面，LG、MG与HG三组表达情况与CG组相比提升明显(P＜0.05)，但KDR和VWF的蛋白表达量则没有显著差异(P＞0.05)；干预方面，LDG与MDG组相较于DG组在CD31、VEGFA、KDR和VWF的蛋白表达水平上均有显著提高(P＜0.05)；而HDG组则在CD31、KDR和VWF的蛋白表达量上显著高于DG组(P＜0.05)。
结论：
1.本研究通过对临床坏死的股骨头样本进行分析，初步了探究了不同病因导致的ONFH的初步机制。
2.补肾活血胶囊可以通过Hedgehog信号通路对GC相关ONFH的SD大鼠骨重建与血管新生具有一定的促进作用。
3.不同浓度的补肾活血胶囊含药血清可以通过Hedgehog信号通路可以调控并促进SD大鼠BMSCs向成骨与成血管方向的分化。
利用Westernblotting方法检测不同病因造成ONFH患者的股骨头样本大致病理形态与其中成骨与成血管相关蛋白的表达情况，为后续SONFH相关基础实验与临床治疗提供一定的理论基础与参照；再通过观察补肾活血胶囊对GC相关的ONFHSD大鼠骨组织重建及血管新生的影响和对GC处理的BMSCs成骨-成血管分化的影响，进一步研究补肾活血胶囊对动物与细胞实验中的成骨、成血管及Hedgehog信号通路相关因子的影响机制。
方法：
1.收集本院在2017年12月至2019年12月期间接受THA手术后的ONFH与股骨颈骨折患者的股骨头样本，挑选符合标准的股骨头按病因分别归入对照组、特发组、酒精组、激素组以及创伤术后组，采用Westernblotting检测不同病因坏死骨组织的成骨与成血管相关指标的蛋白表达情况。
2.通过使用对SD大鼠臀肌注射MPS的方法建立GC相关的ONFH大鼠模型，随后给予不同剂量的补肾活血胶囊加以干预，8周后通过组织病理学观察、荧光定量PCR检测与Westernblotting分析在不同层面综合评价补肾活血胶囊对GC相关的ONFH大鼠骨组织重建及血管新生的影响。
3.运用贴壁法提纯与扩增SD大鼠的BMSCs，并使用不同剂量的补肾活血胶囊含药血清与Dex进行干预培养，观察BMSCs的生长状况、增殖能力以及分化潜能，并采用细胞划痕实验、qPCR检测与Westernblotting分析细胞中成骨、成血管与Hedgehog信号通路相关因子的蛋白表达变化；同时，建立SD大鼠RAOECs与BMSCs共培养体系，并对共培养后的RAOECs进行血管生成实验和Transwell迁移实验，观察其在补肾活血胶囊含药血清与Dex干预培养下的成血管能力与细胞活性的变化。
结果：
1.通过观察各组股骨头样本的大致形态与冠状面，发现不同病因ONFH患者股骨头样本在大致形态与剖面具有较为相似的病理表现，同时有相似的坏死和修复的组织学特征；Westernblotting结果：在成骨方面，ALP蛋白的表达除创伤术后组显著低于对照组外，其余各组间均无显著差异(P＞0.05)；CollgenI蛋白只有特发组与对照组没有统计学差异(P＞0.05)，其余各组表达量均显著低于对照组(P＜0.05)；与对照组相比，激素组、创伤术后组的OPN蛋白表达量均显著降低(P＜0.05)，而特发组、酒精组则无显著差异(P＞0.05)；对照组中RUNX2的蛋白表达量分别显著高于其余各组(P＜0.05)；在成血管方面，不同病因造成的ONFH股骨头样本中CD31、VEGFA与KDR血管生成相关标记物蛋白的表达较对照组均存在显著下降的情况(P＜0.05)；而VWF的蛋白表达量在各组间均未有显著差异(P＞0.05)；在Hedgehog信号通路方面，Shh的蛋白表达量在不同病因的ONFH患者股骨头样本内不存在显著差异(P＞0.05)；与对照组相比，酒精组与创伤术后组样本中信号通路下游细胞内信号因子Gli1的蛋白表达量出现了显著下降(P＜0.05)，而特发组、激素组则未见显著差异(P＞0.05)；各组中细胞内信号因子Gli2的蛋白表达量较对照组均出现了显著减少(P＜0.05)。
2.SD大鼠干预8周后，各组大鼠股骨头样本大体观无明显差异；软件分析HE染色结果显示：CG组骨小梁面积比率显著高与MG组(P＜0.05)，LDG、MDG、HDG三组数据则均显著高于MG组(P＜0.05)；而大鼠空骨陷窝率情况与骨小梁面积比率趋势一致，同为CG组显著高于MG(P＜0.05)且LDG、MDG、HDG剂量三组均显著高于MG组(P＜0.05)；软件分析免疫组织化学染色结果显示：与CG组相比，MG组大鼠股骨头成骨相关指标ALP、CollgenI、OPN与RUNX2不同程度的表达减少(P＜0.05)；而灌胃不同剂量补肾活血胶囊的三个组则显著高于MG组(P＜0.05)；MG组成血管相关指标CD31、VEGFA、KDR与VWF在股骨头中的表达强度相比较CG组均有明显下降(P＜0.05)，而不同剂量补肾活血胶囊灌胃组与MG组相比均有显著升高(P＜0.05)；qPCR检测结果显示：在成骨方面，CG组中ALP、CollgenI和RUNX2的mRNA表达均显著高于MG组(P＜0.05)；LDG组中CollgenI与RUNX2的表达显著高于MG组(P＜0.05)；MDG组中ALP与CollgenI的表达显著高于MG组(P＜0.05)；而HDG组CollgenI的表达显著高于MG组(P＜0.05)；在成血管方面，CG中CD31、VEGFA和KDR的mRNA表达均显著高于MG组(P＜0.05)；LDG组中只有VEGFA的mRNA表达量明显多于MG组(P＜0.05)；MDG组中CD31与VEGFA的mRNA表达量均显著多于MG组(P＜0.05)；而HDG组VEGFA的mRNA表达量明显少于MG组(P＜0.05)；在Hedgehog信号通路方面，CG组中Shh、Gli1和Gli2的mRNA表达量均明显多于MG组(P＜0.05)；LDG组中则有Gli1和Gli2的表达显著高于MG组(P＜0.05)；MDG组与HDG组中Shh、Gli1和Gli2的mRNA表达情况均显著高于MG组(P＜0.05)；Westernblotting结果分析显示：CG组样本中成骨相关ALP、CollgenI、OPN和RUNX2蛋白表达均显著高于MG组，而经过补肾活血胶囊LDG组中CollgenI、OPN和RUNX2三种蛋白表达情况均显著高于MG组表达(P＜0.05)；MDG组中ALP、CollgenI和OPN三种蛋白表达均显著高于MG组(P＜0.05)；HDG组显中ALP与CollgenI著高于MG组(P＜0.05)；CG样本中成血管相关CD31、VEGFA、KDR和VWF四种蛋白表达均显著高于MG组，而LDG组中VEGFA、KDR两种蛋白表达情况均显著高于MG组表达(P＜0.05)；而MDG组中VEGFA与KDR两种蛋白表达均显著高于MG组(P＜0.05)，而CD31与VWF的表达则显著低于MG组(P＜0.05)；HDG组显中KDR和VWF著高于MG组(P＜0.05)；CG组样本中Hedgehog信号通路相关Shh、Gli1和Gli2蛋白三种蛋白表达均显著高于MG组，而经过补肾活血胶囊干预的LDG组中仅有Gli2蛋白表达情况显著高于MG组表达(P＜0.05)；而MDG组中Shh和Gli2两种蛋白表达均显著高于MG组(P＜0.05)；HDG组显中也仅有Gli2蛋白的表达著高于MG组(P＜0.05)。
3.本研究采用贴壁法可以提纯高纯度的原代SD大鼠BMSCs；原代BMSCs可顺利进行成骨、成脂与成软骨诱导分化；不同浓度的补肾活血胶囊含药血清不进对原代BMSCs具有促进增殖的作用，并且还可显著提高经Dex处理过的原代BMSCs的增殖活性；成骨诱导3周后，茜素红染色显示不同浓度补肾活血胶囊含药血清低、中、高剂量组与对照组染色结果相似，较模型组显著升高；BMSCs划线实验24h时，CG组与LDG、MDG、HDG三组的划线平均宽度均显著低于DG组(P＜0.05)，且48h时趋势与24h时保持一致；将与SD大鼠BMSCs在不同浓度补肾活血胶囊含药血清与Dex进行共培养后的RAOECs进行血管生成实验，对CG与LDG、MDG、HDG三组的血管分支数量指标均显著高于MG组(P＜0.05)；而在血管分支总长度指标上，CG组总长度数值显著高于DG组(P＜0.05)，而MDG与HDG组的血管分支总长度显著高于DG组(P＜0.05)；Transwell迁移实验结果表明：DG组迁移的细胞数量显著少于CG组(P＜0.05)；MDG组迁移细胞数则显著多与DG组(P＜0.05)；而LDG、HDG组迁移细胞数与模型组不存在显著差异(P＞0.05)；qPCR结果显示：在Hedgehog信号通路方面，相比较于CG组，DG组中Shh、Gli1和Gli2的mRNA表达量均出现显著减少(P＜0.05)；在含药血清方面，LG、HG组中Shh、Gli1和Gli2指标的mRNA表达量均显著多于CG组(P＜0.05)，而MG组中的Shh和Gli2的mRNA表达情况较CG组均出现显著提高(P＜0.05)；在干预方面，与DG组相比，MDG与HDG组中Shh、Gli1和Gli2各指标的mRNA表达量均出现显著升高(P＜0.05)，而LDG组中的Shh和Gli2表达均显著高于DG组(P＜0.05)；成骨方面，DG组相较于CG组ALP、CollgenI和RUNX2的mRNA表达量均有显著降低(P＜0.05)；在含药血清方面，LG组中ALP、CollgenI和RUNX2的mRNA表达均显著高于CG组(P＜0.05)，而MG与HG组中的ALP和RUNX2表达均显著高于CG组(P＜0.05)；在干预方面，MDG组中ALP、CollgenI和RUNX2的mRNA表达均显著高于DG组(P＜0.05)，LDG组中CollgenI和RUNX2的表达显著高于DG组(P＜0.05)，而HDG组中ALP和CollgenI的表达则显著高于DG组(P＜0.05)；成血管方面：CG组的CD31、VEGFA和KDR的mRNA表达均显著高于DG组(P＜0.05)；LG、MG与HG组中CD31、VEGFA和KDR的mRNA表达均显著高于CG组(P＜0.05)；在干预方面，MDG与HDG组中CD31、VEGFA和KDR的mRNA表达均显著高于DG组(P＜0.05)，LDG组中VEGFA和KDR的mRNA表达量皆显著多于DG组(P＜0.05)；Westernblotting结果分析显示：在Hedgehog信号通路方面，DG组BMSCs的Shh、Gli1和Gli2三种蛋白的表达量相较于CG组均有明显降低(P＜0.05)；LG组中的Shh、Gli1和Gli2各指标蛋白表达程度较CG组有显著增加(P＜0.05)；MG、HG组中Gli1的蛋白表达量与CG组相比也有显著提升(P＜0.05)；干预方面，LDG与MDG组相较于DG组的Shh、Gli1和Gli2三种蛋白表达量均有显著提高(P＜0.05)；而HDG组则只有Gli2蛋白表达显著高于DG组P＜0.05)；在成骨方面，DG组BMSCs的ALP、CollgenI、OPN和RUNX2蛋白表达水平相较于CG组均有明显降低(P＜0.05)；HG组中的ALP、CollgenI、OPN和RUNX2蛋白表达量均显著均高于CG组(P＜0.05)；MG组中CollgenI、OPN和RUNX2的蛋白表达量显著高于CG组(P＜0.05)；LG组中CollgenI和OPN的蛋白表达量显著高于CG组(P＜0.05)；干预方面，MDG与HDG组相较于DG组的ALP、CollgenI、OPN和RUNX2蛋白表达水平方面均有显著提高(P＜0.05)；而LDG组则在ALP、CollgenI和RUNX2的蛋白表达量上显著高于DG组(P＜0.05)；在成血管方面，CG组BMSCs的CD31、VEGFA、KDR和VWF蛋白表达水平均显著高于DG组(P＜0.05)；在CD31和VEGFA蛋白表达水平方面，LG、MG与HG三组表达情况与CG组相比提升明显(P＜0.05)，但KDR和VWF的蛋白表达量则没有显著差异(P＞0.05)；干预方面，LDG与MDG组相较于DG组在CD31、VEGFA、KDR和VWF的蛋白表达水平上均有显著提高(P＜0.05)；而HDG组则在CD31、KDR和VWF的蛋白表达量上显著高于DG组(P＜0.05)。
结论：
1.本研究通过对临床坏死的股骨头样本进行分析，初步了探究了不同病因导致的ONFH的初步机制。
2.补肾活血胶囊可以通过Hedgehog信号通路对GC相关ONFH的SD大鼠骨重建与血管新生具有一定的促进作用。
3.不同浓度的补肾活血胶囊含药血清可以通过Hedgehog信号通路可以调控并促进SD大鼠BMSCs向成骨与成血管方向的分化。